沉香葉黃酮類化合物的提取及其抗氧化活性

段宙位，李維國，竇志浩′*，謝 輝，何 艾，史 敏

（1.海南省農業科學院農產品加工設計研究所，海南 海口 571100；2.海南省熱帶作物栽培生理學重點實驗室，海南 儋州 571737）

沉香葉黃酮類化合物的提取及其抗氧化活性

段宙位1，李維國2，竇志浩1′*，謝 輝1，何 艾1，史 敏1

（1.海南省農業科學院農產品加工設計研究所，海南 海口 571100；2.海南省熱帶作物栽培生理學重點實驗室，海南 儋州 571737）

以沉香葉為原料，采用溶劑浸提的方法提取黃酮類化合物，利用1′1-二苯基-2-三硝基苯肼（1′1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）法、2′2-聯氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2′2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）法和鐵氰化鉀還原法測定提取物的抗氧化能力。在單因素試驗的基礎上，選擇乙醇體積分數、提取溫度、液料比為自變量，以黃酮類化合物得率為響應值，采用響應面法優化提取工藝。結果表明，沉香葉黃酮類化合物提取的最優工藝為乙醇體積分數60%、提取溫度60 ℃、液料比20∶1（mL/g）、提取時間3 h，在此條件下黃酮類化合物的得率為2.88%（m/m）。抗氧化實驗結果表明，沉香葉黃酮提取物具有較強的清除DPPH自由基和ABTS＋·能力，其半數有效質量濃度值分別為（1.14±0.08） mg/mL和（0.23±0.01） mg/mL。

沉香葉；黃酮類化合物；提取工藝；抗氧化活性

沉香為瑞香科植物沉香（Aquilaria agallocha Roxb.）或白木香（Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg）含黑色樹脂的木質部，前者主要產于印度和馬來西亞等國，稱為進口沉香，后者主要產于我國海南、廣東、廣西等省區，稱為國產沉香，也稱海南沉[1]。沉香為珍貴瀕危的中藥材，醫用價值高，醫界謂之“世之珍稀”。海南沉香種植面積較大，自2006年啟動5萬 畝“萬畝人工種植沉香”工程后，據不完全統計，2013年海南沉香種植面積達3萬 畝，約300萬 株，沉香種植量呈逐年增長的趨勢。沉香樹在生長過程中，需要及時修枝、剪枝，以促進其快速生長，在此過程中產生大量的副產物——沉香葉。據報道，沉香葉中含有多糖[2]、氨基酸[2]、酚類[3]、黃酮及苷類[4-5]等多種化合物，這些化合物具有多種生物活性。如黃酮類化合物具有抗氧化[6-7]、抗衰老[8]、降血糖[9-10]、抗腫瘤[11-12]、抗抑郁[13]等作用，應用前景廣闊。

黃酮類化合物是沉香葉的主要活性成分之一，目前已從沉香葉中鑒別出芫花素、木犀草素、木栓酮、羥基芫花素等多種黃酮類化合物[2′14]。然而，關于沉香葉黃酮類化合物的提取及其抗氧化性方面的研究尚未見相關報道。因此，本課題以沉香葉為原料，提取其中的黃酮類化合物，測定其抗氧化性，對開發天然抗氧性化合物、綜合利用沉香葉資源、提高沉香的附加值具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沉香葉（白木香）采自瓊海市東平國營農場；蘆丁標準品、1′1-二苯基-2-三硝基苯肼（1′1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國Sigma公司；2′2-聯氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2′2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS） 上海生工生物工程有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

CPA225D電子天平 德國Sartorius公司；恒溫搖床 上海世平實驗設備有限公司；723C可見分光光度計 上海欣茂儀器有限公司；循環水式真空泵、RE-52AA式旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 原料預處理

將沉香葉洗凈，50 ℃烘干，粉碎，過60 目篩，備用。

1.3.2 黃酮類化合物含量的測定

采用硝酸鋁顯色法測定黃酮類化合物含量[15]，略有改動。移取0.25 mL樣品液于10.0 mL的具塞試管中，用蒸餾水定容至5.0 mL。分別向其中加入5%的亞硝酸鈉溶液0.5 mL，靜置6 min；再加入10%的硝酸鋁溶液0.5 mL，再靜置6 min；最后向其中加入1mol/L的NaOH溶液4.0 mL，靜置15 min。同時用蒸餾水代替樣品液做空白對照，于510 nm波長處測定吸光度。

1.3.3 沉香葉黃酮類化合物得率的測定

1.3.3.1 標準方程的建立

稱取蘆丁標準品10 mg，用60%的乙醇溶液配制成0.2 mg/mL的蘆丁標準溶液，分別移取0.2 mg/mL的蘆丁標準溶液（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL）于10.0 mL的具塞試管中，用蒸餾水定容至5.0 mL。采用1.3.2節方法測定吸光度，以蘆丁質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，建立標準曲線方程：y = 11.975x—0.032 5，R2=0.999 6，蘆丁標準溶液在0.02～0.10 mg/mL范圍內線性關系良好。

1.3.3.2 黃酮類化合物得率的計算

取不同條件下提取的樣液，測定吸光度，按下式計算黃酮類化合物得率。

式中：A為樣液吸光度；M為樣品質量/g；40為總的稀釋倍數；V為樣液體積/mL。

1.3.4 沉香葉黃酮類化合物提取單因素試驗

1.3.4.1 乙醇體積分數對得率的影響

稱取沉香葉粉末10 g，按液料比15∶1（mL/g），分別加入體積分數40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，置于50 ℃的恒溫搖床（180 r/min）中浸提3.0 h。取上清液，測定吸光度，計算得率。

1.3.4.2 提取溫度對得率的影響

稱取沉香葉粉末10 g，按液料比15∶1（mL/g），加入體積分數60%的乙醇溶液，分別置于45、50、55、60、65 ℃的恒溫搖床（180 r/min）中浸提3.0 h。取上清液，測定吸光度，計算得率。

1.3.4.3 液料比對得率的影響

稱取沉香葉粉末10 g，分別按液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g），加入體積分數60%的乙醇溶液，置于60 ℃的恒溫搖床（180 r/min）中浸提3.0 h。取上清液，測定吸光度，計算得率。

1.3.4.4 提取時間對得率的影響

稱取沉香葉粉末10 g，按液料比20∶1（mL/g），加入體積分數60%的乙醇溶液，置于60 ℃的恒溫搖床（180 r/min）中分別浸提2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h。取上清液，測定吸光度，計算得率。

1.3.5 響應面優化提取試驗

采用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken試驗設計原理設計響應面試驗。考慮到提取時間達到3 h時，黃酮類化合物的溶出基本達到平衡，得率變化不大，根據單因素試驗結果，選取對黃酮類化合物得率變化影響相對較大的3 個因素（乙醇體積分數、提取溫度、液料比）作為試驗因素，以黃酮類化合物得率為響應值設計試驗，優化沉香葉黃酮類化合物提取工藝。

1.3.6 抗氧化實驗

將沉香葉黃酮提取物濃縮干燥，稀釋成不同的質量濃度梯度，采用DPPH法[16-17]、ABTS法[18]、還原力法[19]測定沉香葉黃酮提取物的抗氧化活性，以VC做陽性對照。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇體積分數對黃酮類化合物得率的影響

由圖1可知，當乙醇體積分數小于60%時，隨著乙醇體積分數的提高，得率增加；當乙醇體積分數大于60%時，隨著乙醇體積分數的提高，得率減少；在體積分數60%時達到最大值。這可能是因為不同體積分數的乙醇極性不同，隨著乙醇體積分數的增加，破壞黃酮類物質與蛋白質、多糖等物質之間的氫鍵與疏水相互作用力增強，黃酮類化合物溶出增加，得率增大；乙醇體積分數過高，有機溶劑與沉香葉黃酮類化合物間的極性差異增大，黃酮類化合物溶出減少，同時，一些醇溶性雜質、色素、親脂性強的成分溶出量增加，這些成分與黃酮類化合物競爭同乙醇-水分子結合，從而導致黃酮類化合物得率下降。因此，選擇乙醇體積分數在60%左右進行后續優化試驗。

圖1 乙醇體積分數對黃酮類化合物得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of flavonoids

2.1.2 提取溫度對黃酮類化合物得率的影響

圖2 提取溫度對黃酮類化合物得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of flavonoids

由圖2可知，當提取溫度小于60 ℃時，隨著溫度的升高，得率逐漸增加；當提取溫度大于60℃時，隨著溫度的升高，得率有所下降，這可能是因為溫度升高，分子運動速度加快，滲透、擴散、溶解速度加快，黃酮類化合物的得率升高；但是，過高溫度可能引起黃酮類化合物結構被氧化破壞導致其得率降低。因此，選擇提取溫度在60 ℃左右進行后續優化試驗。

2.1.3 液料比對黃酮類化合物得率的影響

圖3 液料比對黃酮類化合物得率的影響Fig.3 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of flavonoids

由圖3可知，隨著液料比的增大，黃酮類化合物的得率逐漸增大，當液料比達到20∶1（mL/g）時，再增大液料比，得率變化不大，這是因為液料比20∶1（mL/g）時，黃酮類化合物的溶解基本達到完全。通過對得率、溶劑用量和能量耗損的綜合考慮，選擇液料比在20∶1（mL/g）左右進行后續優化試驗。

2.1.4 提取時間對黃酮類化合物得率的影響

圖4 提取時間對黃酮類化合物得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of flavonoids

當提取時間小于3 h時，隨著時間的延長，得率逐漸上升，這是因為提取時間小于3 h時，黃酮類化合物還未充分溶出；當提取時間在3.0～4.0 h時，隨著時間的增加，得率變化不大，表明當提取達到一定時間時，黃酮類化合物的提取基本達到平衡；4.0 h時，得率略有降低，可能是因為提取時間過長，一些熱敏性組分被破壞引起黃酮類化合物得率略有降低。考慮到得率與提取效率，提取時間選擇3 h為宜。

2.2 響應面法優化提取工藝條件

2.2.1 回歸模型建立與分析

表1 Box-Behnken試驗設計及結果Table1 Box-Behnken experimental design and corresponding results

根據Box-Behnken試驗設計原理，以沉香葉黃酮類化合物得率為響應值，設計三因素三水平的響應面分析試驗，采用Design-Expert 8.0.6進行數據分析。通過Design-Expert軟件對表1中響應面與各因素進行回歸擬合，得到沉香葉黃酮類化合物得率（Y）對乙醇體積分數（A）、提取溫度（B）、液料比（C）編碼值的二次多項回歸方程為：Y=2.89＋0.073A—0.024B＋1.250×10—3C＋0.067AB＋0.063AC—0.025BC—0.20A2—0.22B2—0.066C2。

表2 響應面試驗結果方差分析表Table2 Analysis of variance of each term in the response surface regression mmooddeell

回歸模型各項系數的顯著性檢驗結果和方程的方差分析結果見表2。由表2可知，該回歸模型是極顯著的（P＜0.01）。回歸模型的決定系數R2=0.977 3，校正決定系數=0.948 2，失擬項P=0.214 3＞0.05，不顯著，說明該回歸模型與試驗數據擬合程度高，誤差小。因此，可以用該模型分析和預測沉香葉黃酮類化合物提取的效果。根據表2，模型中A、A2、B2差異極顯著，AB、AC、C2差異顯著，其余項差異均不顯著；3個因素對得率的影響程度依次為A＞B＞C，即乙醇體積分數＞提取溫度＞液料比。

2.2.2 沉香葉黃酮類化合物提取工藝的響應面分析

圖5 乙醇體積分數與提取溫度對黃酮類化合物得率的影響Fig.5 Interaction effects of ethanol concentration and extraction temperature on the yield of flavonoids

用Design-Expert軟件對表1數據進行三元二次回歸擬合，所得回歸方程的響應面圖，見圖5～7。

從圖5可以看出，響應面的坡度較陡，等高線為橢圓形，說明乙醇體積分數與提取溫度交互作用較強，對黃酮類化合物得率的影響較大；乙醇體積分數的曲面相對于提取溫度較陡，說明乙醇體積分數對黃酮類化合物得率的影響比提取溫度大。

圖6 乙醇體積分數與液料比對黃酮類化合物得率的影響Fig.6 Interaction effects of ethanol concentration and liquid-to-solid ratio on the yield of flavonoids

從圖6可以看出，響應面的坡度較陡，等高線為橢圓形，說明乙醇體積分數與液料比交互作用強，對黃酮類化合物得率的影響較大；乙醇體積分數的曲面相對于液料比較陡，說明乙醇體積分數對黃酮類化合物得率的影響比液料比大。

圖7 提取溫度與液料比對黃酮類化合物得率的影響Fig.7 Interaction effects of extraction temperature and liquid-to-solid ratio on the yield of flavonoids

從圖7可以看出，響應面的坡度較平緩，等高線為圓形，說明提取溫度與液料比交互作用弱，對黃酮類化合物得率的影響不大；提取溫度的曲面相對于液料比較陡，說明提取溫度對黃酮類化合物得率的影響比液料比大。

2.2.3 提取工藝的優化及驗證實驗

在提取時間為3 h條件下，在選取的各因素范圍內，通過Design-Expert 8.0.6對回歸模型分析得出，沉香葉黃酮的最佳提取工藝條件為：乙醇體積分數61.95%、提取溫度59.84 ℃、液料比20.53∶1（mL/g）。考慮到操作的便利，確定黃酮類化合物提取的最佳工藝條件為：乙醇體積分數60%、提取溫度60 ℃、液料比20∶1（mL/g）、提取時間3 h。在此條件下，進行3 次平行實驗，黃酮類化合物得率平均值為2.88%，與理論值（2.90%）比較接近。說明該回歸方程與實際情況擬合較好，充分證明了該回歸方程的可靠性。沉香葉黃酮類化合物的得率明顯高于李敏[20]從銀杏葉中提取黃酮得率的1.63%，說明沉香葉中黃酮類化合物的含量較高，提取效果較好。

2.3 抗氧化活性的測定

2.3.1 DPPH自由基清除率的測定

圖8 提取物（a）與VC（b）質量濃度對DPPH自由基清除率的影響Fig.8 Concentration-dependent scavenging activity of flavonoid-rich extract and VC against DPPH free radical

由圖8可知，沉香葉黃酮提取物對DPPH自由基具有一定的清除能力，且隨質量濃度的增加而增強。在低質量濃度0.5～1.75 mg/mL范圍內服從線性分布y=6.54＋38.084x，R2=0.992 1，根據線性回歸方程，求出沉香葉黃酮的半數有效質量濃度（median effective concentration，EC50），即清除率為50%所需樣品質量濃度為（1.14±0.08） mg/mL。同樣根據線性方程y=—25.81＋13 187.943x，R2=0.993 2，求出VC的EC50值為（0.005 7±0.000 4） mg/mL。沉香葉黃酮提取物清除DPPH自由基能力弱于VC，這可能是因為黃酮提取物為混合物，純度低，雜質較多，抑制了其活性。一般認為某種物質的EC50值低于10 mg/mL，表明其具有較好的抗氧化性[21]，況且沉香葉黃酮提取物清除DPPH自由基能力強于鄭義等[21]提取的益智仁黃酮提取物，可見其仍表現出較強的DPPH自由基清除效果。

2.3.2 ABTS＋·清除率的測定

由圖9可知，隨著沉香葉黃酮提取物質量濃度的增加，各提取物對ABTS＋·的清除率也隨之增大，在0.1～0.5 mg/mL范圍內服從線性分布y=5.54＋195.819x，R2=0.984 1，求出沉香葉黃酮EC50值（0.23±0.01） mg/mL。同樣根據線性回歸方程y=—2.04＋7 815.952x，R2=0.991 8，求出VC的EC50值為（0.006 7±0.000 4） mg/mL。可見，沉香葉黃酮提取物具有清除ABTS＋·效果，但仍弱于VC。

圖9 提取物（a）與VC（b）質量濃度對ABTSABTS＋·清除率的影響Fig.9 Concentration-dependent scavenging activity of flavonoid-rich extract and VC against ABTS free radical

2.3.3 還原力的測定

圖10 提取物（a）與VC（b）質量濃度 對還原力的影響Fig.1 0 Concentration-dependent reducing power of flavonoid-rich extract and VC

已有研究表明[22]，抗氧化活性與還原力之間普遍存在相關性，可通過測定還原力來表示抗氧化活性強弱，吸光度越高，還原能力越強。由圖10可知，沉香葉黃酮類提取物具有一定的還原能力，與自由基清除率相似，隨提取物質量濃度的增加而增強，在0.1～0.5 mg/mL范圍內服從線性分布y=0.086 5＋1.753 7x，R2=0.996 3。VC具有較強的還原能力，在0.001～0.005 mg/mL范圍內服從線性分布y=0.063 3＋165.374 0x，R2=0.980 9。可見VC的還原能力明顯強于沉香葉黃酮提取物，但沉香葉黃酮提取物仍表現出較強的還原力，這與清除DPPH自由基和ABTS＋·表現的抗氧化效果類似。

3 結 論

在單因素試驗的基礎上，選擇乙醇體積分數、提取溫度、液料比為自變量，以黃酮類化合物得率為響應值，采用Box-Behnken法設計三因素三水平的響應面試驗優化提取工藝。結果表明，沉香葉黃酮類化合物提取的最優工藝為：乙醇體積分數60%、提取溫度60 ℃、液料比20∶1（mL/g）、提取時間3 h。在此條件下黃酮類化合物的得率為2.88%（m/m）。沉香葉黃酮提取物具有較強的抗氧化活性，清除DPPH自由基、ABTS＋·能力與還原力均隨提取物質量濃度增加而增強；其清除DPPH自由基、ABTS＋·的EC50值分別為（1.14±0.08） mg/mL和（0.23±0.01） mg/mL。

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Extraction and Antioxidant Activity of Flavonoids from Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg Leaves

DUAN Zhouwei1′LI Weiguo2′DOU Zhihao1′*′XIE Hui1′HE Ai1′SHI Min1
(1. Institute of Processing amp Design of Agroproducts Hainan Academy of Agricultural Science Haikou 571100′China; 2. Hainan Provincial Key Laboratory of Cultivation Physiology for Tropical Crops Danzhou 571737′China)

In this study flavonoids were extracted from the leaves of Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg by solvent extraction method and assessed for their antioxidant activities by 1′1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH radical scavenging′2′2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate) (ABTS radical scavenging and potassium ferricyanide reduction assays Ethanol concentration extraction temperature and liquid-to-solid ratio were identified by single factor method as main variables that affect the extraction yield of flavonoids The levels of the three variables were optimized by response surface methodology The optimum extraction conditions were found to be extraction at 60 ℃ for 3 h using 60% aqueous ethanol with a liquid-to-solid ratio of 20:1 (mL/g)′leading to an extraction yield of 2.88% (m/m). The antioxidant assays showed that the extracted flavonoids presented a strong antioxidant activity to scavenge DPPH and ABTS radicals with median effective concentrations (EC50) of (1.14 ± 0.08) mg/mL and (0.23 ± 0.01) mg/mL respectively.

Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg leaves flavonoids extraction antioxidant activity

TS202.3

A

1002-6630（2015）06-0045-06

10.7506/spkx1002-6630-201506009

2014-08-25

海南省自然科學基金項目（314155）；中國熱帶農業科學院橡膠研究所省部重點實驗室/科學觀測試驗站開放課題（RRI-KLOP1408）；海南省科研院所技術開發專項（KYYS-2014-35）

段宙位（1985—），男，研究實習員，碩士，研究方向為農產品加工。E-mail：universeduan@163.com

*通信作者：竇志浩（1961—），男，研究員，學士，研究方向為農產品加工與保鮮。E-mail：513408658@qq.com