杜氏鹽藻與4 種海洋微藻間的化感作用*

潘遠健，金剛，代建國，丁莉，張麗君，欒崇林，于化泓

（1.深圳職業技術學院 深圳市大規模細胞培養技術和細胞資源庫公共技術服務平臺，廣東 深圳 518055；2.南昌大學 生命科學與食品工程學院，江西 南昌 330031）

PAN Yuanjian1，2, JIN Gang1, DAI Jianguo1, DING Li1, ZHANG Lijun1, LUAN Chonglin1, YU Huahong2

（1. Shenzhen Polytechnic，Shenzhen Public Technology Service Platform for Scale Cell Culture Techniques and Cell Resource，Shenzhen,Guangdong 518055, China; 2. Department of Life Sciences and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang, Jiangxi 330031, China）

杜氏鹽藻與4 種海洋微藻間的化感作用*

潘遠健1，2，金剛*1，代建國1，丁莉1，張麗君1，欒崇林1，于化泓2

（1.深圳職業技術學院 深圳市大規模細胞培養技術和細胞資源庫公共技術服務平臺，廣東 深圳 518055；2.南昌大學 生命科學與食品工程學院，江西 南昌 330031）

利用交叉培養結合高效液相色譜分析的方法，研究了杜氏鹽藻與球等鞭金藻、叉鞭金藻、湛江等鞭金藻和小球藻之間的化感作用，并測定了受試后球等鞭金藻和杜氏鹽藻的SOD活力．結果表明：（1）杜氏鹽藻與球等鞭金藻、青島叉鞭金藻、湛江等鞭金藻及小球藻之間存在著顯著的化感作用，其中，湛江等鞭金藻、青島叉鞭金藻胞外濾液對杜氏鹽藻的生長有明顯的抑制作用，杜氏鹽藻胞外濾液明顯地抑制小球藻的生長；（2）青島叉鞭金藻、湛江叉鞭金藻、球等鞭金藻和小球藻胞外濾液萃取物分別至少由6種、8 種、6 種和6種物質組成；（3）微藻胞外濾液對受試藻SOD酶活性有明顯影響．

微藻；杜氏鹽藻；化感作用

由水體富營養化導致的有害藻類暴發性生長，已成為一個世界性的環境問題[1]．傳統的藻類控制方法主要有化學、物理和微生物抑藻、動物捕食等．這些方法都不同程度地存在缺陷，如產生次二次污染、費用高等．而藻類的化感作用為解決上述問題提供了一種新穎的思路．化感作用是物種之間的基本生態關系之一，通過分泌至周圍環境的化感物質來調節物種的數量或者產生其它生態效應．化感物質通常是植物生長過程中產生的次級代謝物，它們對藻類的化感作用專一性較好，并且一般都能在自然條件下降解[2]．因此，植物化感作用控藻方法是一種生態安全性好，有良好的應用前景的方法．已有較多研究涉及陸生植物和大型水生植物的提取物對藻類生長的控制效果．例如 Nakai 等研究表明，水生植物可以通過連續釋放化感物質來抑制藻類的生長[3]．但是，微藻之間的化感作用報道還不多．

本實驗以微藻的胞外濾液作為基礎實驗用液，運用交叉培養的方法[4]，探討分析了球等鞭金藻（Isochrysis galbana）、叉鞭金藻(Dicrateria inornata)、湛江等鞭金藻(Isochrysis zhangjiangensis Hu. Var. sp)以及小球藻（Chlorella vulgaris）與杜氏鹽藻（Dunaliella salina）間的化感作用，同時通過測定受試藻的SOD活力和高效液相色譜分析球等鞭金藻等4種海洋微藻胞外濾液的萃取物，以期獲知胞外濾液中化感物質的相關信息，為利用化感作用原理應用于經濟微藻的生產和水體富營養化的治理提供有價值的參考．

1 材料和方法

1.1 藻種

杜氏鹽藻、球等鞭金藻、叉鞭金藻、湛江等鞭金藻和小球藻為本實驗室保存，經傳代培養后作為實驗材料．

1.2 主要儀器和試劑

Spectra Max M2酶標儀（北京九宇鑫泰生物技術有限公司），高效液相色譜儀（深圳寶域科技有限公司），凈化工作臺（蚌埠凈化設備廠），280高壓滅菌鍋（上海申安醫療器械廠），微量移液槍，小型離心機，SOD活力測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）．

1.3 微藻胞外濾液的制備

采用PES培養液培養微藻，鹽度為30.5‰，培養溫度為（25±1）℃．培養液所用海水為人工配制海水，高溫滅菌冷卻后待用．所用試驗器皿先經浸泡，烘干，高壓滅菌，冷卻后使用．試驗操作均在超凈工作臺無菌條件下進行．培養液體積為150 mL．培養條件：光照強度3000 Lux，光暗周期12 L：12 D．每天搖動培養瓶3次并隨機調換擺放位置，以防止藻細胞附壁沉淀和減少光照誤差．

微藻胞外濾液的收集方法：培養 15 d 后，將生長至衰退期的供體藻離心收集其藻液，用滅菌人工海水(鹽度為30.5‰)離心洗滌l-2次．再往無菌藻體中加入50 mL的無菌人工海水，混勻，置于光照培養架中浸提．3d后離心收集上清液．上清液需多次離心直至上清中鏡檢不出藻體，再用無菌0.22 μm微孔濾膜過濾一次，以完全去除藻體．所得上清液即為微藻胞外濾液，儲存于4 ℃保存備用．

1.4 微藻在胞外濾液中的培養

1.4.1 杜氏鹽藻在4種海洋微藻胞外濾液中的培養

將4種微藻胞外濾液按不同體積比分別加入PES培養基，體積比分別為 0、20%、40%、60%、80%，各配制100 mL，分別接種6×105/ mL的杜氏鹽藻，置于組培架培養，溫度 25℃，光照強度3000 Lux，光暗周期為12 L：12 D，每個培養瓶設定3 個平行樣．

1.4.2 微藻的胞外濾液萃取物的制備以及萃取物對杜氏鹽藻生長的影響

將4 種微藻胞外液各 100 mL pH調至2.5，用乙酸乙酯萃取，50 ℃蒸干后，將萃取物分別加入100 mL PES培養基中，均用于培養杜氏鹽藻，接種密度為 6×105/mL ．培養條件同1.4.1．

1.5 SOD酶活力的測定

分別取球等鞭金藻和小球藻0～60%體積比胞外濾液作用后鹽藻的待測藻液40 mL，6000 r/min離心5 min，傾去上清夜，加入5 mL的0.1mol/L的磷酸鈉緩沖液(pH7.0)混勻，6000 r/min離心5 min，重復洗滌一次．再離心后得到的藻體當中加入5mL磷酸鈉緩沖液(pH.70)．在冰水浴條件下用超聲波細胞破碎機600W 破碎5min，再于4000 r/min離心10 min，上清液即為超氧化物歧化酶SOD粗酶液，用于SOD活力的測定．

SOD活性按試劑盒說明測定．

1.6 微藻胞外濾液萃取物的高效液相色譜分析

取適量微藻胞外濾液萃取物，用乙酸乙酯溶解后，進行高效液相色譜分析．色譜條件：流動相為乙腈-水（體積比為70:30）；色譜柱ZORBAX Eclipse XDB-Cl8，ID 4.6 mm×150 mm，5 μm；0.3 mL / min恒流洗脫；檢測波長：UV-235 nm，進樣量10μL．

2 結 果

2.1 四種海洋微藻胞外濾液對杜氏鹽藻生長的影響

通過測量藻細胞的光密度值，依據光密度值與細胞密度之間的關系，可簡便快捷地得知微藻的生長情況[5,6]．圖1顯示了杜氏鹽藻在4種海洋微藻胞外濾液不同體積比混合液中的生長曲線．從圖1可以看出，當湛江等鞭金藻、叉鞭金藻胞外濾液體積比大于20%時，對杜氏鹽藻的生長都有明顯的抑制作用，并且這種抑制作用隨胞外濾液體積比的增大而加強．球等鞭金藻胞外濾液體積比較低時，明顯促進杜氏鹽藻生長，而體積比大于60%時，抑制了杜氏鹽藻的生長．小球藻胞外濾液體積比在0～20%時，對杜氏鹽藻的生長起促進作用，而體積比大于20%時則抑制杜氏鹽藻的生長．

2.2 杜氏鹽藻胞外濾液對四種海洋微藻生長的影響

由圖 2可以看出，杜氏鹽藻胞外濾液明顯地抑制了小球藻的生長，并且隨胞外濾液比例的增大對小球藻生長的抑制作用更加明顯．然而，當胞外濾液體積比大于20% 時，杜氏鹽藻胞外濾液明顯地促進了球等鞭金藻的生長．杜氏鹽藻胞外濾液對叉鞭金藻和湛江等鞭金藻的影響有所不同，當濾液體積比在 20%～40%范圍時，杜氏鹽藻胞外濾液促進了叉鞭金藻的生長，當濾液體積比在 20%～60%范圍內，杜氏鹽藻胞外濾液明顯地促進湛江等鞭金藻的生長，僅當胞外濾液體積比大于80% 時對其生長才呈現抑制作用．

2.3 微藻的胞外濾液萃取物對杜氏鹽藻生長的影響

4種海洋微藻胞外濾液的萃取物對杜氏鹽藻生長的影響結果如圖3所示．除了球等鞭金藻的胞外濾液萃取物可以促進杜氏鹽藻的生長以外，其余均抑制杜氏鹽藻的生長，且抑制作用類似于它們各自的胞外濾液對杜氏鹽藻生長的抑制效果．

2.4 SOD酶活性

SOD對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，它可以清除自由基，使細胞免受傷害，能夠使植物在一定程度上忍耐、減緩或抵抗逆境脅迫．有研究發現，蘆葦中分離得到的抑藻活性組分能夠降低藻細胞中超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）的活性，引起某些脂類的過氧化①Li F M, Hu H Y. Isolation and characterization of a novel antialgal allelochemical from Phragmites communis[J]. Applied and Environmental Microbiology, (in press).．SOD酶活性越高，其抵抗力越強[7]．

球等鞭金藻和小球藻胞外濾液體積比在0～60%范圍內，對杜氏鹽藻SOD活性的影響分別如圖4和圖5所示．從圖4可以看出，在球等鞭金藻胞外濾液對杜氏鹽藻的作用中，40%的胞外濾液SOD活性最大，說明藻體內抗氧化系統得到了增強，SOD活性上升，以清除體內產生的過量的自由基，進而減輕藻體所受到的傷害，提高其抵抗力和促進細胞增殖．在圖5中，小球藻藻胞外濾液體積比為20%時，杜氏鹽藻SOD活性最高，隨后逐漸降低，表明細胞液中自由基由少變多，機體內受到了一定的傷害，從而抑制細胞增殖．

圖1 4種微藻胞外濾液對杜氏鹽藻生長的影響

圖2 杜氏鹽藻胞外濾液對4中微藻生長的影響

圖3 微藻胞外濾液萃取物對杜氏鹽藻的生長的影響

圖4 杜氏鹽藻胞外濾液對球等鞭金藻SOD活力的影響

圖5 小球藻胞外濾液對杜氏鹽藻SOD活力的影響

圖6 4種微藻胞外濾液物質組成液相色譜圖

2.5 微藻的胞外濾液萃取物的高效液相色譜分析結果

利用高效液相色譜分析了4 種海洋微藻胞外濾液萃取物的成分（圖6）．青島叉鞭金藻胞外濾液萃取物產生6個主要峰（圖6a），出現時間分別為6.768，8.013，9.846，10.630，12.924，26.017 min．湛江叉鞭金藻胞外濾液萃取物產生8個主要峰（圖6b），出現時間分別為4.950，6.814，8.051，8.905，9.832，10.814，12.939，25.650 min．球等鞭金藻胞外濾液萃取物產生6個主要峰（圖6c），出現時間分別為6.825，8.045，9.830，10.814，12.924，25.606 min．小球藻胞外濾液萃取物產生6個主要峰（圖6d），出現時間分別為6.817，8.078，9.821，10.798，12.898，25.564min．由此可知，叉鞭金藻，湛江叉鞭金藻，球等鞭金藻和小球藻胞外濾液萃取物分別至少由6種、8 種、6 種和6種物質組成．這些物質的具體化學信息還有待進一步研究．

3 討 論

化感效應包括3種類型：抑制效應、促進效應和中性效應[8]．目前，已經有相關文獻報道了雨生紅球藻 （Haematococcus pluvialis）[9]、中肋骨條藻 （Skeletonema costatum）[10]、強壯前溝藻（Amphidinum carterae Hulburt）、青島大扁藻（Platymonas helgolondica var.tsingtaoensis）[11]和某些赤潮微藻[12,13]等微藻的化感作用．本研究利用交叉培養方法確定了杜氏鹽藻與球等鞭金藻、叉鞭金藻、湛江等鞭金藻和小球藻之間存在著顯著的化感作用（圖1和圖2）．其中，球等鞭金藻、杜氏鹽藻胞外濾液對彼此之間的生長起相互促進作用．而湛江等鞭金藻和叉鞭金藻胞外濾液對杜氏鹽藻，以及杜氏鹽藻胞外濾液對小球藻的抑制作用則比較顯著，說明同一種藻對不同的受體藻會產生多種的化感效應類型．杜氏鹽藻與湛江等鞭金藻的相互化感效應類型不同，其中湛江等鞭金藻胞外濾液對杜氏鹽藻的生長產生促進作用，而杜氏鹽藻胞外濾液對湛江等鞭金藻的生長則產生抑制作用．

本研究結果顯示，在所選5種海洋微藻中，叉鞭金藻、湛江等鞭金藻和小球藻的胞外濾液的乙酸乙酯萃取物能明顯抑制杜氏鹽藻的生長，球等鞭金藻的胞外濾液的乙酸乙酯萃取物則能促進杜氏鹽藻的生長．因此，這不僅證明杜氏鹽藻與球等鞭金藻等4種海洋微藻間存在著顯著的化感作用，同時也說明這4種海洋微藻胞外濾液中的化感物質可以通過有機溶劑提取獲得．其它研究也有類似結果[1]．本研究還發現，受杜氏鹽藻各個體積比胞外濾液作用的球等鞭金藻SOD酶活性均顯著高于對照組，可能的原因是其SOD酶活性足以保護其免受傷害，使生物量免遭不利影響，該藻的抗逆性得到加強，提高了機體的生理生化機制，從而加快藻細胞的生長繁殖速度．杜氏鹽藻SOD活力在高濃度（60%）的小球藻胞外濾液作用下低于對照組，SOD酶的平衡遭受破壞且新的平衡難以重新建立，從而導致細胞受到損傷，其細胞密度和生物量的增長受到抑制．因此筆者認為，微藻生長環境發生改變時，SOD酶活性間接的體現了受體藻的促進和抑制效應類型，即受體藻SOD酶活性高，濾液對其生長會產生促進作用，活性低則反之，二者間很可能存在某種線性關系．

通過高效液相譜法（HPLC）較好地分離出小球藻，叉鞭金藻，球等鞭金藻和湛江等鞭金藻的胞外濾液萃取物的成分．由圖6可知，這些微藻濾液中存在著數量不等和種類不同的化感物質．杜氏鹽藻和球等鞭金藻均為營養價值和經濟價值較高的微藻，兩者之間的胞外濾液可以相互促進彼此的生長，同時杜氏鹽藻胞外濾液還可以對小球藻產生抑制作用，為利用化感作用原理應用于經濟微藻的生產和水體富營養化的治理上提供一定參考．

[1] Paerl H W and Huisman J. Climate change: a catalyst for global expansion of harmful cyanobacterial blooms[J]. Environmental Microbiology Reports, 2009（1）：27-37．

[2] 肖溪．大麥秸稈對藍藻化感抑制作用與機理的研究[D]．浙江大學，2012．

[3] Nakai S, Inoue Y, Hosomi M, et al. Growth inhibition of blue-green algae by allelopathic effects of marophytes[J]. Water Science and Technology, 1999，39（8）：47－53．

[4] 孫穎穎，閻斌倫，王長海．球等鞭金藻與 4 種海洋微藻間的化感作用[J]．海洋通報，2009，28（5）：79-84．

[5] 蔡卓平，段舜山，朱紅惠．三角褐指藻在多波長下藻液吸光度與細胞密度的關系研究[J]．廣東藥學院學報，2012，28（6）：608-611．

[6] 黃莉莉，代建國，金剛，等．鱟素和硫酸多黏菌素 B對小球藻的抑制效應及機理[J]．江蘇農業科學，2011（3）：537-540．

[7] 王海娟，段昌群，郭濤．不同污染經歷的玉米在高低溫脅迫下 SOD 酶活性的變化[J]．云南大學學報（自然科學版），2004，26（1）：80-84．

[8] 張珍萍．四種海洋微藻間的化感作用效應研究[D]．暨南大學，2005．

[9] 孫艷妮，殷明炎，劉建國．雨生紅球藻的信號物質[J]．海洋湖沼通報，2001（3）：22-28．

[10] Imada N, Kobayashi K, Tahara K, et al. Production of an Autoinhibitor by Skeletonema costatum and its effect on the growth of other phytoplankpyrenoidosa[J]. Nippon Suisan Gakkaishi, 1991，57（12）：2285-2290．

[11] 郝雯瑾，王悠，唐學璽．兩種海洋微藻——強壯前溝藻與青島大扁藻之間的相互作用研究[J]．中山大學學報（自然科學版），2008（S1）．

[12] Perez E, Martin D E, Padilla M. Rate of production of APONINs by Nannochloris oculata[J]. Biomed Lett, 1999，59：88-91．

[13] Arzul G, Segue L M, Guzman L, et al. Comparison of allelopathic properties in three toxic Alexandrium species [J]. J Exp Mar Biol Ecol, 1999，232：285-295．

Allelopathy Between Dunaliella Salina and Four Species of Marine Microalgae

Together with high performance liquid chromatography (HPLC) analysis, the method of cross culture is applied to research the allelopathy among the Dunaliella salina, Isochrysis galbana, Dicrateria inornata, Isochrysis zhangjiangensis and Chlorella vulgaris. Besides, the SOD activity of I. galbana and D. salina is measured. Results indicate that: ① a significant allelopathy exists among the D. salina, I. galbana, D. inornata, I. zhangjiangensis and C. vulgaris, in which the extracellular filtrate of Isochrysis zhangjiangensis and Dicrateria inornata distinctively inhibits the growth of D. salina; the extracellular filtrate of D. salina inhibits the growth of C. vulgaris. ② The extracellular filtrate of D. inornata, I. zhangjiangensis, I. galbana and C. vulgaris respectively consists of at least 6, 8, 6, 6 kinds of components; ③ The extracellular filtrate has obvious influence on the SOD enzyme activity of the subjected algae.

marine microalgae; Dunaliella salina; allelopathy

PAN Yuanjian1，2, JIN Gang1, DAI Jianguo1, DING Li1, ZHANG Lijun1, LUAN Chonglin1, YU Huahong2

（1. Shenzhen Polytechnic，Shenzhen Public Technology Service Platform for Scale Cell Culture Techniques and Cell Resource，Shenzhen,Guangdong 518055, China; 2. Department of Life Sciences and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang, Jiangxi 330031, China）

Q178.532

A

1672-0318（2015）03-0047-07

10.13899/j.cnki.szptxb.2015.03.011

2014-07-10

*項目來源：深圳市科技項目（JC201005280534A，JCY20130331151022276）；廣東省自然科學基金資助項目（10151805501000007）

潘遠健 (1987-)，男，漢族，廣西梧州人，碩士研究生，主要從事生物學研究．

*通訊作者：金剛，教授，E-mail：jingang@szpt.edu.cn．