Ion Torrent PGMTM系統檢測孕婦血漿中胎兒游離DNA

劉亞楠，趙雪瑩，平原，徐慶文，黃江平，鄒凱南，周懷谷

（1.上海市公安局物證鑒定中心法醫物證學現場應用技術公安部重點實驗室上海市現場物證重點實驗室，上海 200083；2.上海市刑事科學技術研究院，上海 200083）

Ion Torrent PGMTM系統檢測孕婦血漿中胎兒游離DNA

劉亞楠1，趙雪瑩2，平原1，徐慶文1，黃江平1，鄒凱南1，周懷谷1

（1.上海市公安局物證鑒定中心法醫物證學現場應用技術公安部重點實驗室上海市現場物證重點實驗室，上海 200083；2.上海市刑事科學技術研究院，上海 200083）

目的探討Ion Torrent PGMTM系統用于孕婦外周血血漿中胎兒游離DNA的Y-STR檢測的可行性。方法采集8例孕晚期（38周）和8例孕中期（12周）的無關孕婦外周血血漿，提取胎兒游離DNA，對DYS390、DYS391、DYS393、DYS438、DYS437、DYS456、DYS635共7個基因座進行復合擴增，在Ion Torrent PGMTM系統進行Y-STR測序分析和毛細管電泳分析，并將兩者結果進行比較。結果在分娩男性胎兒的孕晚期及中期孕婦血漿中均檢測到Y-STR片段，測序檢測得出的基因座比毛細管電泳檢測得出的多，且與分娩胎兒的Y-STR基因型相一致。結論Ion Torrent PGMTM系統用于孕婦外周血血漿胎兒游離DNA的Y-STR檢測，具有高靈敏度、高通量的特點，且有較好的法醫學應用價值。

法醫遺傳學；Y染色體；孕婦；胎兒；短串聯重復序列；Ion Torrent PGMTM系統

在各類刑事案件中，會遇到因為強奸致孕而涉及需要在妊娠期間進行親子鑒定的案件。在實際偵查辦案中，一方面，被害人希望及時終止妊娠，另一方面，為了確保獲得胎兒的遺傳信息以便確認犯罪嫌疑人，偵查部門希望受害者能在孕齡12周后流產取證。

自上世紀70年代第一代測序技術的問世，DNA測序技術發展突飛猛進，到2010年美國Thermo Fisher公司推出了一款個人化操作基因組測序儀——Ion Torrent Personal Genomic MachineTM（Ion Torrent PGMTM），該測序儀是基于半導體芯片的新一代測序技術，單次反應可檢測幾十至幾百萬條DNA分子，具有反應速度快、操作簡便、數據質量較高等優點。本研究旨在利用Ion Torrent PGMTM測序系統，對孕晚期和孕中期孕婦外周血中胎兒游離DNA的Y-STR基因型進行檢測，比較

基于傳統毛細管電泳的熒光檢測方法和新一代測序方法在無創性產前親子鑒定中的優劣，探索孕婦外周血在強奸致孕案件中的應用價值，建立孕婦外周血胎兒游離DNA的Ion Torrent檢測方法，為強奸致孕案件中親子鑒定技術的發展提供基礎性研究和新手段。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

按照知情同意原則，采集8例孕晚期（38周）和8例孕中期（12周）孕婦外周血樣本各2mL（EDTA抗凝），并采集其分娩后胎兒的臍帶組織作為對照。

1.2 DNA提取及分組

實驗組：在4℃條件下，取8例孕晚期孕婦和8例孕中期孕婦外周血樣本各2mL，1600×g離心10min，吸取600μL上清液。在4℃條件下，將吸取的600μL上清液，16000×g離心10min，取上清液。應用血漿、血清游離核酸提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取孕婦外周血游離DNA。

對照組：取8例孕晚期和8例孕中期孕婦分娩后胎兒臍帶組織各1cm×1cm。應用EZ1 DNA Investigator提取試劑盒（德國QIAGEN公司）提取臍帶組織DNA。

1.3 聚合酶鏈反應

1.3.1 引物

選取Y-STR基因座DYS390、DYS391、DYS393、DYS438、DYS437、DYS456、DYS635，以Primer 3 Plus軟件針對每一基因座設計引物。引物序列見表1。

表1 Y染色體STR基因座的引物序列

1.3.2 PCR擴增

實驗組：應用GlobalFilerTM試劑盒（美國Thermo Fisher公司）對8例孕晚期和8例孕中期孕婦外周血DNA樣本進行復合擴增，反應體系均為15 μL，引物混合液0.17mol/L，反應混合液20μL。反應條件均為：95℃1 min；94℃3 s，60℃30 s，共32個循環；60℃8min，4℃保存。

對照組：應用Yfiler誖PCR擴增試劑盒（美國Thermo Fisher公司）對8例孕晚期和8例孕中期孕婦分娩后胎兒臍帶組織DNA樣本進行復合擴增，反應體系為25 μL，反應液10 μL，引物混合液5 μL，金牌酶0.5μL。反應條件：95℃11min；94℃1min，61℃1min，72℃1 min，共35個循環；60℃80 min，4℃保存。

1.4 文庫構建

應用Qubit dsDNA HS Assay試劑盒（美國Thermo Fisher公司）在Qubit 2.0定量平臺（美國Thermo Fisher公司）測定PCR產物濃度。采用Ion Plus Fragment Library試劑盒（美國Thermo Fisher公司）和Ion Xpress Barcode Adapter試劑盒（美國Thermo Fisher公司），在片段兩端分別連接有標簽序列（Barcode）的接頭和測序接頭構建文庫，并純化。

1.5 模板制備和測序

模板制備采用Ion PGMTMTemplate OT2 400試劑盒（美國Thermo Fisher公司），利用Ion OneTouchTM2.0系統進行乳濁液PCR以及產物富集。

測序采用Ion PGMTMSequencing 400試劑盒（美國Thermo Fisher公司），選擇Ion 316 v2芯片，利用Ion Torrent PGMTM系統完成測序反應。

1.6 數據分析

測序數據使用Ion Torrent PGMTM系統配套分析設備Torrent Suite（4.0）進行分析。根據Barcode和引物序列對有效測序片段進行拆分及序列比對，通過聚類分析讀取STR核心序列，STR基因型的命名參考STRBase[1]。毛細管電泳數據采用GeneMapper軟件進行分析。本研究對實驗組的孕婦外周血樣本和對照組的胎兒臍帶組織樣本分別讀取Y-STR核心序列并進行一一比對，以此檢驗Ion Torrent PGMTM系統用于孕婦外周血胎兒游離DNA Y-STR檢測的可靠性。

2 結果與討論

2.1 測序結果

本研究采用Ion Torrent PGMTM系統對孕中期和孕晚期樣本進行測序，以其中一塊Ion 316 v2芯片為例，結果如圖1。芯片中有效區域達87%，其中連接文庫為100%。除去28%的多克隆、35%的低質量文庫和0%的測試片段，最終有效文庫為47%，共2.5×106個讀取片段，片段平均讀長為156bp。產生的原始測序數據總量為378Mb。

圖1 Ion Torrent PGMTM系統的測序結果

2.2 測序結果遺傳學分析

8 名孕晚期孕婦和8名孕中期孕婦外周血血漿樣本中，8例孕晚期和5例孕中期均檢測出Y-STR等位基因，3例孕中期未檢測出Y-STR等位基因。胎兒出生后證實8例孕晚期孕婦的胎兒均為男胎，8例孕中期孕婦的胎兒中5例為男胎，3例為女胎（表2）。

7 個基因座擴增產物長度均為220 bp以下，以DYS393基因座擴增產物的片段長度最小（約117bp），擴增效果好，檢出率最高；以DYS437基因座產物的片段長度最大（約213bp），擴增效果好，檢出率較低。據文獻[2]報道，分娩男嬰的孕婦外周血血漿樣本中游離DNA含量在妊娠中期平均為36基因組當量/mL，在妊娠晚期為176基因組當量/mL。受胎兒結構完整性的限制，即當胎兒細胞經過胎盤屏障，細胞整體結構被母體的免疫系統所破壞，胎兒的有核紅細胞破裂，DNA進入孕婦血液循環[3]，這可能是片段大的等位基因擴增效果差的原因之一。

本實驗選取了7個Y-STR基因座進行復合擴增，擴增產物應用Ion Torrent PGMTM系統進行測序，并選取孕婦分娩后男性胎兒臍帶組織DNA作為對照，同時應用Yfiler誖PCR擴增試劑盒對上述樣本進行Y-STR的毛細管電泳熒光檢測分析以驗證孕婦外周血胎兒游離DNA分型結果的準確性。孕晚期和孕中期孕婦外周血的游離DNA在Ion Torrent PGMTM系統測序方法檢測出等位基因的基因座比毛細管電泳熒光檢測出的基因座多，說明Ion Torrent PGMTM系統靈敏度要遠遠高于熒光檢測平臺。對比孕晚期和孕中期，發現孕晚期檢測出的基因座比孕中期多（表3），這可能與孕婦外周血的胎兒游離DNA量隨著孕期延長而增加有關[4]。表3中，孕晚期檢出的7個Y-STR基因座，毛細管電泳檢測到的Y-STR樣本數量為0～3個，平均（1.57±0.98）個，測序法檢測到的Y-STR樣本數量為7～8個，平均（7.14±0.69）個，其差異具有統計學意義（P＜0.05）。孕中期檢出的7個Y-STR基因座，毛細管電泳檢測到的Y-STR樣本數量為0～1個，平均（0.43±0.54）個，測序法檢測到的Y-STR樣本數量為2～5，平均（4.43±1.13）個，其差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表2 孕中期孕婦外周血血漿和分娩后臍帶組織Ion Torrent PGMTM測序等位基因分型結果

表3 孕中、晚期孕婦外周血血漿和臍帶組織中Y-STR的毛細管電泳和Ion Torrent PGMTM測序檢出結果比較

2.3 Y-STR的等位基因分型

應用Ion Torrent PGMTM系統測序得到Y分型與男性胎兒檢測分型相一致，準確性達到100%，但是存在個別樣本位點少量缺失的現象，這可能與孕婦外周血血漿中的游離DNA量極少，且游離DNA完整性受限制有關[3]。

對Y-STR的毛細管電泳檢測分析結果顯示，每例樣本只能獲得0～3個基因座的等位基因，無法明確判定基因型。而測序結果顯示，7個基因座中共檢測出21個等位基因，具體序列見表4。

結果顯示，采用Ion Torrent PGMTM測序法進行Y-STR檢測，能夠同時獲取Y-STR長度多態性及序列多態性信息，極大地提高其應用于親子鑒定的識別率。

表4 Ion Torrent PGMTM測序檢測Y-STR基因座的等位基因分型結果

2.4 結論

本研究建立了Ion Torrent PGMTM系統對孕婦外周血中的游離DNA進行Y-STR測序檢測的方法，可以通過Ion Torrent PGMTM系統盡早檢測被害人外周血游離DNA的Y-STR基因分型，為確定犯罪嫌疑人提供佐證。我們將進一步對孕婦外周血游離胎兒DNA常染色體STR基因座的檢測進行研究，為其在法庭科學中的應用提供更大價值。

[1]Ruitberg CM，Reeder DJ，Butler JM.STRBase：a short tandem repeat DNA database for the human identity testing community[J].Nucleic Acids Res，2001，29（1）：320-322.

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[4]Lo YM，Zhang J，Leung TN，et al.Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma[J].Am J Hum Genet，1999，64（1）：218-224.

Application of Ion Torrent PGMTMSystem in Detection of Fetal DNA in Maternal Plasma

LIU Ya-nan1,ZHAO Xue-ying2,PING Yuan1,XU Qing-wen1,HUANG Jiang-ping1,ZOU Kai-nan1,ZHOU Huai-gu1
（1.Shanghai Key Laboratory of Crime Scene Evidence,Key Laboratory of Forensic Evidence and Science Technology,Ministry of Public Security,Institute of Forensic Science,Shanghai Public Security Bureau, Shanghai 200083,China;2.Shanghai Research Institute of Criminal Science and Technology,Shanghai 200083,China）

Objective To explore the feasibility of detecting of Y-STR of fetal DNA in maternal plasma using Ion Torrent PGMTMSystem.Methods A total of 16 fetal DNA samples from maternal plasmas（8 cases from 38 weeks gestational age and 8 ones from 12 weeks）were prepared and a multiplex assay with 7 STR loci（DYS390,DYS391,DYS393,DYS438,DYS437,DYS456,DYS635）was designed for multiplex-PCR amplification.Using Ion Torrent PGMTMSystem,the results of Y-STR sequences and capillary electrophoresis were obtained and compared.Results Y-STR specific alleles were detected in the maternal plasma of all the pregnant women having male babies of second and third trimester,which were higher than that detected by capillary electrophoresis.Consistent Y-STR genotypes were observed between fetal DNA from maternal plasma and genomic DNA from the newborn babies.Conclusion Based on Ion Torrent PGMTMSystem,the prenatal Y-STR detection method may provide a high-sensitive and high-throughput choice for prenatal STR detection in forensic testing.

forensic genetics;Y chromosome;pregnant women;fetus;short tandem repeat sequences; Ion Torrent PGMTMSystem

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2015.06.005

1004-5619（2015）06-0432-04

2015-07-31）

（本文編輯：李成濤）

公安部科技強警基礎工作專項資助項目（2013GABJC 005）

劉亞楠（1981—），男，碩士，主檢法醫師，主要從事法醫DNA分析技術的應用和研究；E-mail：dyndai@sina.cn

周懷谷，男，博士，主任法醫師，主要從事法醫DNA分析技術的應用和研究；E-mail：hgzhou803@hotmail.com