LC-MS/MS檢測生物檢材中雷公藤甲素和雷公藤酯甲

翟金曉，劉偉

（1．司法部司法鑒定科學技術研究所上海市法醫學重點實驗室，上海 200063；2.蘇州大學醫學部基礎醫學與生物科學學院，江蘇蘇州 215123）

LC-MS/MS檢測生物檢材中雷公藤甲素和雷公藤酯甲

翟金曉1，2，劉偉1

（1．司法部司法鑒定科學技術研究所上海市法醫學重點實驗室，上海 200063；2.蘇州大學醫學部基礎醫學與生物科學學院，江蘇蘇州 215123）

目的建立生物檢材中雷公藤甲素和雷公藤酯甲的液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）分析方法，并進行方法學驗證。方法0.4mL血液、尿液或0.4g肝組織加入內標混勻后用乙酸乙酯進行提取，提取物經Allure PFP Propyl柱（100mm×2.1mm，5μm）分離，以甲醇-20mmol/L乙酸銨溶液梯度洗脫，采用電噴霧正離子化（ESI+）、多反應監測檢測雷公藤甲素和雷公藤酯甲。結果各生物檢材中雷公藤甲素和雷公藤酯甲在相應的線性范圍內線性良好（r>0.9950），檢出限均為2ng/mL或2ng/g，回收率為61.08%～102.98%，日內精密度和日間精密度均小于12.58%，準確度為90.61%～105.80%。結論所建方法簡便、選擇性好，適用于同時分析各種生物檢材中的雷公藤甲素和雷公藤酯甲，為雷公藤中毒的法醫學鑒定和臨床診治提供技術保障。

法醫毒理學；色譜法，液相；串聯質譜法；雷公藤甲素；雷公藤酯甲；生物檢材

雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）為衛矛科（Celastraocse）雷公藤屬植物，是我國重要的天然藥物資源，主要分布在長江以南[1]。雷公藤也是近半個世紀以來發生中毒事件最多的中草藥之一。雷公藤全株均有不同程度的毒性，嫩芽及葉最大，木質部最小[2]。雷公藤甲素，又稱雷公藤內酯醇、雷公藤內酯，是從雷公藤中分離的具有松香烷結構的三環氧二萜內酯類化合物，是雷公藤藥材及其制劑的主要有效成分之一，也是引起毒副作用的主要成分[3-4]。我國臨床上應用的各種雷公藤制劑多數以其作為主要活性成分。生藥中也以雷公藤甲素的含量多少來評價藥材質量的好壞[5]。雷公藤酯甲屬于三萜類成分，具有較強的抗感染及免疫抑制作用，同時具有明顯的毒副作用，主要表現在消化系統、生殖系統、心血管系統、骨髓及血液

系統等[6]。雷公藤多苷片的主要成分為雷公藤酯甲，其質量標準中含量測定是以雷公藤酯甲作為對照，采用薄層掃描法進行測定[7]。雷公藤的治療劑量與中毒劑量非常接近，療效與劑量呈明顯的量效關系[8]。雷公藤嫩葉7個尖（約12 g）即可致死，服其葉2～3片可中毒，根的韌皮部30～60 g可致死，一般中毒后24 h死亡，最多不超過4d[9]，因攝入雷公藤中毒及死亡的案（病）例時有報道[10-11]。

對雷公藤及雷公藤制劑的成分、檢測及提取方法已有了廣泛的研究[12-14]。目前對體外雷公藤甲素或雷公藤酯甲的檢測方法應用最為廣泛的是高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[15-16]，對于體內雷公藤甲素的檢測方法主要是液相色譜-大氣壓化學源-質譜法（liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization-tandem mass spectrometry，LC-APCI-MS）[17-18]和液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS），后者包括LC-APCI-MS/MS[13]和LC-ESI-MS/MS[14，19]。本研究旨在建立液液提取技術和LC-ESI-MS/MS同時檢測血液、尿液及肝組織中痕量雷公藤甲素和雷公藤酯甲的分析體系，以簡便、快速、準確、可靠地滿足雷公藤中毒鑒定的需要，為雷公藤中毒的法醫學鑒定、臨床診斷及救治提供科學的手段，并對此方法進行方法學驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

API 4000 Q trap四極桿-線性離子阱質譜儀（美國AB公司），配AcquityTMUltra Performance LC超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；XW-80A渦旋混合器（上海醫科大學儀器廠）；MD200-2氮吹儀（杭州奧盛儀器有限公司）；TDZ4-WS離心機（賽特湘儀離心機儀器有限公司）；MINSPIN高速離心機（德國Eppendorf公司）。

1.1.2 藥品與試劑

對照品雷公藤甲素、雷公藤酯甲（純度≥98%）購自中國藥品生物制品檢定所；內標納洛酮（純度≥98%）購自中國藥品生物制品檢定所。

乙腈（HPLC級）、甲醇（HPLC級）均購自美國Sigma-Aldrich公司，乙酸銨（HPLC級）購自Fluka公司，甲酸（優級純）、乙酸乙酯（分析純）和乙醚（分析純）均購自上海國藥集團化學試劑有限公司，超純水由Milli-Q（Millopore純水系統）制得。

空白全血（經肝素抗凝）、空白尿液均由近期未服用過目標藥物的健康志愿者提供，空白肝為市售新鮮豬肝。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

對照品溶液：分別精密稱取對照品雷公藤甲素及雷公藤酯甲5mg于5mL容量瓶中，加入甲醇溶解配制成質量濃度均為1mg/mL的對照品儲備液，密封儲存于-18℃冰箱中，待用。實驗中所用的其他濃度的對照品溶液均由上述對照品儲備液用甲醇稀釋而得。

內標溶液：精密稱取對照品納洛酮10mg于10mL容量瓶中，加入甲醇配制成質量濃度為1 mg/mL的納洛酮儲備液。取納洛酮儲備液適量用甲醇稀釋得2μg/mL的內標甲醇工作液。

20 mmol/L乙酸銨溶液：稱取乙酸銨1.54 g置于1000mL容量瓶中，加入水溶解定容。

混合溶液：V（甲醇）∶V（20mmol/L乙酸銨溶液）= 33∶67。

1.2.2 樣品前處理

取血液或尿液0.4mL，加入2μg/mL納洛酮內標工作液10 μL，渦旋混合1 min，用3 mL乙酸乙酯提取，渦旋混合3min，以1 650×g離心3 min，將上清液轉移至另一試管中，在60℃氮吹儀上吹干，殘留物用80μL混合溶液復溶，供LC-MS/MS分析。

將生物組織研碎，稱取0.4 g，加入2 μg/mL納洛酮內標工作液10μL，渦旋混合1min，用3mL乙酸乙酯提取，渦旋混合3 min，1 650×g離心5 min，將上清液轉移至另一試管中，在60℃氮吹儀上吹干，殘留物用80μL混合溶液復溶，復溶液置于微量離心管中-20℃冷凍過夜，次日以1 650×g離心3 min，取上清液于進樣小瓶中，供LC-MS/MS分析。

1.2.3 儀器條件

（1）液相條件。色譜柱：Allure PFP Propyl（100mm× 2.1 mm，5 μm），前接Phenomenex保護柱。流動相：A（甲醇）-B（20 mmol/L乙酸銨緩沖溶液），洗脫程序為0～3min，V（A）∶V（B）=33∶67，流速為0.2mL/min；3～ 7min，V（A）∶V（B）=5∶95，流速為0.3mL/min；7～10min，V（A）∶V（B）=33∶67，流速為0.3mL/min。柱溫：室溫。進樣量：10μL。

（2）質譜條件。電噴霧正離子化（ESI+），多反應監測（MRM）檢測。離子源電壓（IS）：5 500 V。氣簾氣（CUR）：206.8kPa。霧化氣（GS1）：206.8kPa。輔助氣2（GS2）：413.7kPa。離子源溫度（TEM）：500℃。

按上述條件，通過質譜參數優化，分別得到由雷公藤甲素、雷公藤酯甲和內標納洛酮的母離子與其兩個子離子組成的兩對母離子/子離子對。各離子對的駐留時間均為150ms。定性分析以各化合物的兩對母離子/子離子對進行，并以第一對離子對進行定量分析。定性、定量離子對、去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）和保留時間（tR）見表1。

表1 雷公藤甲素和雷公藤酯甲與內標納洛酮的MS/MS參數

2 結果

2.1 方法的選擇性

對10份不同來源的空白血液、空白尿液及空白肝按照“1.2.2樣品前處理”進行操作，按“1.2.3儀器條件”進行分析，并與相同空白基質中添加兩種目標物及內標的添加樣品比較。結果表明，空白樣品在目標物及內標出峰時間上無響應，說明空白內源性基質無干擾，方法的選擇性良好。空白血液及空白血液中添加目標物的MRM色譜圖見圖1。

2.2 線性范圍、檢出限和定量限

分別取空白血液、空白尿液和空白肝各0.4mL（g）若干份，加入內標工作液10 μL，加入雷公藤甲素和雷公藤酯甲對照品溶液適量，配制成質量濃度分別為2、5、10、20、50、80、100、200、400、500ng/mL（g）的雷公藤甲素和雷公藤酯甲血液、尿液和肝的樣品，其中將10、100、400 ng/mL（g）作為質控樣品，質控樣品每一濃度6份，其余樣品每一濃度為2份，以前述方法進行樣品前處理和測定。分別以雷公藤甲素和雷公藤酯甲的峰面積與內標物的峰面積比（y）對雷公藤甲素和雷公藤酯甲濃度（x，ng/mL或ng/g）作線性回歸，得到血液、尿液和肝的線性方程及相關系數，并以信噪比S/N≥3的濃度得到檢出限（LOD），S/N≥10的濃度得到定量限（LOQ），結果見表2。

圖1 空白血液及添加血液的MRM色譜圖

表2 血液、尿液及肝中雷公藤甲素和雷公藤酯甲的線性方程、相關系數、LOD及LOQ

2.3 提取回收率和基質效應

分別取空白血液、空白尿液和空白肝各0.4mL（g）若干份，同上法配制成含雷公藤甲素和雷公藤酯甲低、中、高3個濃度［10、100、400 ng/mL（ng/g）］的質控樣品各6份，按照前述方法進行樣品前處理后進樣分析，所得各目標物的峰面積為A1；相同的空白基質同法處理后，在吹干的殘余物中加入一定量濃度的對照品溶液配制成相應質量濃度的溶液，定容，進樣分析，所得目標物的峰面積為A2；提取回收率=A1/A2×100%；另取相應濃度的對照品溶液，吹干后用混合溶液定容后進樣分析，測得目標物的峰面積為A3，基質效應= A2/A3×100%，結果見表3。

2.4 精密度和準確度

分別取空白血液、空白尿液和空白肝各0.4mL（g）若干份，同上法配制成含雷公藤甲素和雷公藤酯甲低、中、高3個濃度［10、100、400ng/mL（ng/g）］的質控樣品各6份，按照前述方法進行樣品前處理后進樣分析。以當日工作曲線計算各樣品中的雷公藤甲素和雷

公藤酯甲的含量，求得6份質控樣品的準確度和日內精密度（RSD）。同法連續測定4 d，計算日間精密度（RSD），結果見表3。

由表3中可見，各樣品中雷公藤甲素和雷公藤酯甲的日內精密度和日間精密度均在12.58%以內，準確度為90.61%～105.80%，提取回收率為61.08%～102.98%，基質效應為76.67%～105.96%，可以滿足生物檢材中毒物分析的要求。

表3 各檢材中雷公藤甲素和雷公藤酯甲的準確度、精密度、提取回收率和基質效應（%）

2.5 穩定性

取空白血液0.4mL若干份，同上法配制雷公藤甲素和雷公藤內酯甲低、中、高3個質量濃度（10、100、400ng/mL）的質控樣品，分別考察4種不同保存條件下［室溫下放置24 h、3個反復凍融循環（-20℃到室溫）、經樣品前處理后的樣品提取物室溫放置24 h、-20℃條件下冷凍保存1個月］樣品的穩定性，每種條件下每個濃度樣品各6份。

結果顯示，血液樣品在室溫下放置24h、-20℃反復凍融、處理后的樣品提取物室溫放置24 h以及在-20℃條件下冷凍保存1個月的4種條件下，樣品的相對偏差均小于14.60%，表明血液樣品在上述保存條件下的穩定性較為良好。

3 討論

3.1 樣品前處理方法的選擇

一般而言，生物樣品是不能直接進樣分析的，必須經過一定的前處理步驟來去除樣品中的脂質、內源性蛋白等雜質成分。樣品前處理是生物樣品分析中的一個關鍵步驟，在LC-MS/MS分析中，常用蛋白沉淀、液液提取、固相萃取等方法對生物樣品進行分離純化。由于雷公藤甲素具有極性小、難溶于水、溶于甲醇、乙酸乙酯、氯仿等的化學性質，常用的液液提取法能很好地將其從生物檢材中提取出來。本研究比較了乙醚、乙酸乙酯兩個常用的提取溶劑，實驗結果顯示以乙酸乙酯作為提取溶劑時，雷公藤甲素和雷公藤酯甲的提取回收率比用乙醚時略高，故本研究選用了以乙酸乙酯為提取溶劑的液液提取前處理方法。結果表明，以此樣品前處理技術可以得到較高的靈敏度和提取回收率，且操作簡單方便，選擇性強，重現性好。

另一方面，樣品的復溶溶液會對目標物在色譜柱中的色譜行為和離子化效率產生影響，為了得到良好的檢測結果，本研究分別選用甲醇、乙腈、流動相溶液（混合溶液）作為樣品的復溶溶劑，考察進樣后的出峰情況。結果表明，使用混合溶液作為進樣前的復溶溶劑時，目標物的色譜峰峰形對稱，分離度較佳，且兩種物質的色譜峰豐度相對較高。因此本研究選用混合溶液作為樣品的復溶溶液。

3.2 儀器條件的選擇

3.2.1 色譜柱的選擇

本研究考察了幾種不同填料的色譜柱對雷公藤甲素和雷公藤酯甲分離效率的影響，發現Allure Aqueous C18柱（50mm×2.1mm，5μm）及其他規格的C18柱對雷公藤甲素和雷公藤酯甲的分離情況不理想，兩種目標

物的色譜峰保留時間很接近，不能使其有效分離，且峰形不理想，這種情況對定量結果會產生影響，而Allure PFP Propyl柱（100 mm×2.1 mm，5 μm）可使雷公藤甲素和雷公藤酯甲完全分離，且峰形較窄，沒有明顯的拖尾現象，無生物基質的干擾，靈敏度也相對較高，故本研究選擇Allure PFP Propyl（100mm×2.1mm，5μm）色譜柱對待測物進行分析。

3.2.2 流動相的選擇

為達到最佳的離子化效率，獲得最佳的靈敏度，本研究對流動相進行了優化。一般認為，在流動相中加入緩沖鹽如甲酸銨、乙酸銨等，或加入酸性物質如甲酸、乙酸等，可以提高離子化效率，提高靈敏度和改善分離效果。本研究考察了乙腈-20mmol/L乙酸銨緩沖溶液（含0.1%甲酸）、乙腈-20 mmol/L乙酸銨緩沖溶液、甲醇-20mmol/L乙酸銨緩沖溶液三種流動相體系作為流動相，發現流動相中存在甲酸時目標物峰形欠佳，而選用甲醇-20mmol/L乙酸銨緩沖溶液作為流動相時，其分離情況相對較好，且峰型較窄，豐度較高，說明在中性條件下，更利于被測組分離子化和被測組分色譜峰的分離。而由于雷公藤甲素較難電離，且雷公藤甲素和雷公藤酯甲極性差異較大，選用梯度洗脫更能使兩者都得到較好的分離。

3.2.3 質譜母離子、子離子的選擇

分別將雷公藤甲素和雷公藤酯甲的對照品儲備液用甲醇配制成200ng/mL的對照品溶液，采用電噴霧正離子化（ESI+）模式，通過直接進樣法，優化質譜條件，從而確定各分析物的母離子質量數，通過全掃描方式得到各分析物的二級質譜圖。結果在離子源（ESI+）電離模式下，采用全掃描方式可得到雷公藤甲素和雷公藤酯甲的[M+18]+準分子離子峰，依次為m/z 378.4、m/z 472.5，以此作為其母離子。在確定母離子的基礎上選擇兩個豐度較高的子離子與母離子組成兩個母離子/子離子對，并優化去簇電壓（DP），再采用Product Ion方式對子離子碰撞能量（CE）進行優化，使得母離子的強度占最大子離子強度的1/3～1/2時獲得的二級質譜圖為最佳，選擇能產生最高豐度子離子的碰撞能量作為該子離子的最佳碰撞能量。最終選定兩對母離子/子離子對進行定性分析（雷公藤甲素：378.4→361.2，378.4→145.2；雷公藤酯甲472.5→437.2，472.5→191.4），選其中一對離子對（雷公藤甲素：378.4→361.2；雷公藤酯甲472.5→437.2）進行定量分析。

3.3 內標的選擇

分析方法中為得到良好的定量結果，一般選擇內標法定量，由于內標法定量通過測定內標物及被測組分的峰面積相對值來進行計算，因而在一定程度上消除了實驗操作過程所引起的誤差。同位素氘代內標無疑是質譜定量分析的最佳選擇，由于本研究中沒有商品化的雷公藤甲素和雷公藤酯甲的氘代物質，故選用了納洛酮作為內標。選擇納洛酮作為內標的原因在于：（1）樣品中不含有此內標物質；（2）納洛酮色譜峰的保留時間在兩個待測組分之間，三種物質分離良好，峰形均佳；（3）納洛酮性質穩定，在提取溶液中充分溶解且與目標物無化學反應。選擇添加恰當質量濃度的內標物（50 ng/mL），使其峰面積與待測組分相近。結果表明，選擇納洛酮作為內標物對雷公藤甲素和雷公藤酯甲進行定量，獲得了良好的分析結果。

3.4 結論

本研究建立了一種經液液提取后、運用LC-MS/MS檢測多種生物檢材中雷公藤甲素和雷公藤酯甲的方法，該方法操作簡便、靈敏度高、特異性強，適用于同時分析生物檢材中雷公藤甲素和雷公藤酯甲，可為雷公藤中毒的法醫學鑒定和臨床診治提供技術保障。

[1]楊小紅，張偉程.雷公藤制劑的應用及其副作用[J].中醫藥臨床雜志，2004，16（5）：511-512.

[2]童靜，馬瑤，吳建元，等.雷公藤長期毒性作用及其時間節律性研究[J].中藥材，2004，27（12）：933-935.

[3]劉良，王戰勇，黃光照，等.雷公藤甲素亞慢性中毒對昆明種小鼠腎臟及睪丸的影響[J].同濟醫科大學學報，2001，30（3）：214-217.

[4]王君明，賈玉梅，崔瑛.基于以雷公藤甲素為主要抗癌活性成分的雷公藤毒性研究進展及對策[J].時珍國醫國藥，2012，23（3）：558-559.

[5]李波.雷公藤的臨床應用及毒性作用[C]//第五屆全國雷公藤學術會議論文匯編，2008：475-481.

[6]謝誼，王實強，劉可柔.反相高效液相色譜法測定雷公藤多甙片中雷公藤酯甲的含量研究[J].湖南中醫雜志，2007，23（1）：79-80.

[7]中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國衛生部藥品標準：中藥成方制劑（第六冊）[S].1998：275.

[8]馬偉光，張滔，張超，等.有毒藥物雷公藤的研究及展望[J].中華中醫藥雜志，2006，21（2）：117-120.

[9]趙鋮，陳戰瑞，周明彤.雷公藤治療原發性腎病綜合征的肝臟毒副作用觀察[J].臨床薈萃，1998，13（24）：1131-1132.

[10]何松岳.急性雷公藤中毒8例報告[J].浙江預防醫學，2000，12（1）：57-58.

[11]陳林囡，蔡輝，于德勇.雷公藤中毒10例臨床分析[J].江蘇醫藥，1987，（12）：667-668.

[12]陳玉，楊光忠，李援朝.雷公藤化學成分的研究[J].天然產物研究與開發，2005，17（3）：301-302.

[13]Chen KB，Cai MQ，Chen XH，et al.Quantitative analysis of triptolide in human whole blood by LCAPCI-IT-MS-MS[J].Chromatographia，2008，67（3-4）：225-230.[14]Zhuang XM，Liu PX，Zhang YJ，et al.Simultaneous determination of triptolide and its prodrug MC002 in dog blood by LC-MS/MS and its application in pharmacokinetic studies[J].J Ethnopharmacol，2013，150（1）：131-137.

[15]劉建群，劉一文，舒積成，等.HPLC法測定江西雷公藤各部位雷公藤甲素的含量[J].江西中醫藥，2012，43（6）：52-54.

[16]劉法千，鮑立曾，熊仕強.HPLC法測定雷公藤多苷中雷公藤內酯甲的含量[J].中國藥品標準，2007，8（4）：38-40.

[17]Shao F，Wang G，Sun J，et al.Liquid chromatographic/mass spectrometry assay of triptolide in dog plasma and its application to pharmacokinetic study[J]. J Pharm Biomed Anal，2006，41（2）：341-346.

[18]Ouyang XK，Jin MC，He CH.Simultaneous determination of triptolide and tripdiolide in extract of Ttripterygium wilfordii Hook.F.by LC-APCI-MS[J]. Chromatographia，2007，65（5-6）：373-375.

[19]劉萍霞，莊笑梅，王曉霞，等.LC-MS/MS法測定大鼠全血中前藥MC002活性代謝產物雷公藤內酯醇濃度[J].解放軍藥學學報，2009，25（1）：43-45，67.

（本文編輯：于笑天）

Determination of Triptolide and Wilforlide A in Biological Samples by LC-MS/MS

ZHAI Jin-xiao1,2,LIU Wei1
（1.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Institute of Forensic Science,Ministry of Justice,P.R.China,Shanghai 200063,China;2.School of Biology and Basic Medical Sciences,Department of Medicine, Soochow University,Suzhou 215123,China）

Objective To determinate triptolide and wilforlide A in biological samples by liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）method and to verify the method.Methods After 0.4mL blood,urine or 0.4 g hepatic tissues with internal standard were extracted by ethyl acetate,they were separated on a Allure PFP Propyl（100mm×2.1mm,5μm）with a mobile phase of methanol-20mmol/L ammonium acetate using gradient elution.For mass spectrometric detection,electrospray ionization（ESI+）in positive mode was elected and the data was collected using multiple-reaction monitoring（MRM）. Results The linearity was good（r>0.9950）and the limit of detection was 2ng/mL or 2ng/g for triptolide and wilforlide A.The recovery was 61.08%-102.98%.The intra-day and inter-day precision was less than 12.58%for each biological sample,and the accuracy was 90.61%-105.80%.Conclusion This method is simple,convenient and good selective,and could be applied to analysis of triptolide and wilforlide A in different biological samples.And the method may provide technical support for forensic medicine identification,clinical diagnosis and treatment of tripterygium wilfordiiHook.f.poisoning.

forensic toxicology;chromatography,liquid;tandem mass spectrometry;triptolide;wilforlide A;biological samples

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2015.06.008

1004-5619（2015）06-0445-05

上海市科委科研項目（072512019）；上海市法醫學重點實驗室資助項目（14DZ2270800）

翟金曉（1989—），女，碩士，主要從事法醫毒物學研究；E-mail：zhaijinxiao@126.com

劉偉，女，主任法醫師，碩士研究生導師，主要從事法醫毒物學研究；E-mail：liuw@ssfjd.cn