超高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方止顫顆粒中二苯乙烯苷含量

鄭曉青，李 浩

(安徽醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院，安徽合肥 230022)

復(fù)方止顫顆粒由炒白芍、制何首烏、蜈蚣、丹參等十余味藥組成，是我院中醫(yī)科方劑，具有活血化瘀，柔肝通絡(luò)之功效，臨床應(yīng)用近10年，對(duì)于顫病治療效果良好。何首烏為本方劑中的臣藥，而作為何首烏的主要藥效成分之一［1－2］，二苯乙烯苷的含量既是藥效發(fā)揮的關(guān)鍵，也是引起不良反應(yīng)的基礎(chǔ)。《中國(guó)藥典》規(guī)定何首烏中二苯乙烯苷含量不得低于 1.0%［3］。

二苯乙烯苷具有抗氧化、抗衰老、腦保護(hù)、降低膽固醇、抑制腫瘤等作用。近年來(lái)有報(bào)道二苯乙烯苷抗氧化同時(shí)能引起肝臟的損傷，是何首烏引起肝毒性的基礎(chǔ)［4－7］。因此為提高制劑安全性，減少可能引起的肝臟毒性。本課題組運(yùn)用超高效液相色譜法(UPLC)對(duì)制劑中含量進(jìn)行測(cè)定，以期建立快速、便捷的測(cè)定方法，加強(qiáng)醫(yī)院制劑質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司);超聲波清洗儀(江蘇昆山超聲儀器有限公司);電子天平(百萬(wàn)分之一，德國(guó)賽多利斯公司);5 mL容量瓶;圓底燒瓶。

1.2 供試藥品 復(fù)方止顫顆粒由我院制劑室提供，批號(hào):20130425、20130711、20130906;2，3，5，4'－四羥基二苯乙烯－D葡萄糖苷對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定研究院(批號(hào):110844－200607);甲醇(分析純);乙腈(色譜純);乙醇(分析純);蒸餾水。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱使用 Acquity BEH C18(2.1 mm ×50 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相為乙腈—水(27∶73)，流速為0.20 mL·min－1;色譜柱溫度為25℃;檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm。

1.3.2 對(duì)照品溶液制備 取二苯乙烯苷對(duì)照品適量，精密稱定，置5.0 mL容量瓶中，加入甲醇，超聲使其溶解，取出放冷至室溫，再用甲醇定容至刻度，搖勻得對(duì)照品溶液，濃度為0.412 g·L－1，備用。

1.3.3 制備供試品 稱取復(fù)方止顫顆粒5.0 g，研磨制成粉末狀，放置于圓底燒瓶?jī)?nèi)，加稀乙醇100 mL，精密稱定重量，使用超聲儀超聲處理(功率100 W，頻率40 kHz)，1 h后取出，精密稱定，用乙醇補(bǔ)足重量，靜置，取上清液0.45μm過(guò)濾頭過(guò)濾，制成供試品溶液，備用。同時(shí)按照復(fù)方止顫顆粒制劑處方的比例制備缺制何首烏的樣品，按同樣步驟制成陰性對(duì)照溶液。

2 結(jié)果

2.1 專屬性考察 精密吸取對(duì)照品、供試品和陰性對(duì)照溶液各10μL注入超高效液相色譜儀中，結(jié)果顯示陰性對(duì)照溶液對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖1～3。

2.2 線性關(guān)系考察 精密量取二苯乙烯苷對(duì)照品溶液10μL，分別稀釋成梯度質(zhì)量濃度，按照“1.3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣。以二苯乙烯苷濃度為橫坐標(biāo)，AUC為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得二苯乙烯苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 Y=14 332 902.971X－575 593.858(r=0.999 6，n=6)。結(jié)果表明二苯乙烯苷在0.124 0～1.030 0μg范圍內(nèi)與其峰面積 AUC 呈良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取二苯乙烯苷對(duì)照品溶液10 μL，按照:“1.3”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示精密度RSD為0.04%(n=6)，精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液，室溫下按“1.3”項(xiàng)下色譜條件于 0、2、4、8、16、24 h 進(jìn)樣 10 μL，記錄峰面積。RSD 為0.12%(n=6)，結(jié)果表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次復(fù)方止顫顆粒5.0 g，按“2.3”項(xiàng)下制備方法平行制備供試品溶液6份，照“1.3”項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取10 μL，注入色譜儀，記錄AUC。結(jié)果重復(fù)性RSD為0.19%(n=6)，結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批已知含量的樣品6份，精密稱定重量，分別精密加入二苯乙烯苷對(duì)照品適量，按“2.3”項(xiàng)下制備方法制備，照“1.3”項(xiàng)下色譜條件注入色譜儀，記錄AUC，計(jì)算回收率，結(jié)果表明準(zhǔn)確度良好，見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.7 樣品含量測(cè)定 取3批復(fù)方止顫顆粒各5.0 g，按“2.3”項(xiàng)下制備成供試品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣1.0μL測(cè)定，記錄峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算復(fù)方顆粒中二苯乙烯苷的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

隨著《醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑注冊(cè)管理辦法》［8］對(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求的提高，不僅需要對(duì)制劑中的有效成分含量進(jìn)行控制，更需要對(duì)可能引起藥品不良反應(yīng)的成分進(jìn)行控制，對(duì)于中藥復(fù)方來(lái)說(shuō)，兩者往往是同時(shí)存在，發(fā)揮著兩方面的作用。近年來(lái)有關(guān)何首烏的肝毒性的報(bào)道不斷出現(xiàn)于文獻(xiàn)中，本制劑采用的為制何首烏，雖尚未見(jiàn)其有關(guān)肝毒性的報(bào)道，但對(duì)其有關(guān)成分進(jìn)行質(zhì)量控制可有助于提高中藥制劑的安全性。

目前對(duì)中藥復(fù)方制劑的含量測(cè)定大多采用HPLC法，UPLC法是近些年在HPLC的基礎(chǔ)上才發(fā)展起來(lái)的一種新的方法和技術(shù)。與普通HPLC法相比，UPLC法具有分析時(shí)間短、分離度高等特點(diǎn)［9］，本文建立了復(fù)方止顫顆粒中的二苯乙烯苷超高效液相色譜測(cè)定方法，結(jié)果表明，4 min即可完成分析，可以在較短的時(shí)間內(nèi)測(cè)定制劑中的微量成分，相比文獻(xiàn)報(bào)道HPLC測(cè)定方法需20 min以上［10］，本研究建立的方法大大提高了分析的效率，同時(shí)節(jié)省溶劑，降低分析成本，可作為復(fù)方止顫顆粒的質(zhì)量控制方法之一。

［1］楊 杰，周芝文，楊期東，等.二苯乙烯苷對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)保護(hù)的作用機(jī)制［J］.中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2010，35(4):321－328.

［2］徐 杰，周文聰，張緩英.何首烏活性成分－二苯乙烯苷的研究進(jìn)展［J］.泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，29(1):78 －79.

［3］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典(一部)［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:164－165.

［4］高淑紅，蘇珍枝，肖學(xué)鳳.制首烏化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，13(2):74 －77.

［5］辛淑杰.何首烏的藥理作用、臨床應(yīng)用及不良反應(yīng)［J］.北方藥學(xué)，2013，10(7):36 －37.

［6］Aleksunes LM，Klaassen CD.Coordinated regulation of hepatic phaseIandⅡdrug－metabolizing genes and transporters using AhR － ，CAR － ，PXR － ，PPARa－ ，and Nrf2 － null mice［J］.Drug Metab Dispos，2012，40(7):1366 －1379.

［7］Sobocanec S，Balog T，Saric A，et al.Cyp4al4 overxpression induced by hyperoxia in female CBA mice as a possible contributor of increased resistance to oxidative stress［J］.Free Radic Res，2010，44(2):181 －190.

［8］國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑注冊(cè)管理辦法(試行)［S］，2005－08－01.

［9］汪永忠，姜 蕾，韓燕全，等.超高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定丹蛭降糖膠囊中丹皮酚和芍藥苷含量［J］.中國(guó)新藥雜志，2012，21(12):1337－1340.

［10］洪 燕，韓燕全，陳 楊，等.UPLC法測(cè)定黃蒲通竅膠囊中二苯乙烯苷的含量［J］.山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，13(5):28－30.