姜黃素增加U937細胞對TRAIL的敏感性的凋亡機制研究

焦衛云，陳道俊，柯章敏，鮑楊漪

(1.安徽醫科大學第三附屬醫院，安徽合肥 230001;2.安徽醫科大學公共衛生學院，安徽合肥 230032)

白血病是血液系統惡性腫瘤，化療藥物的耐藥及較大的毒副反應使白血病的治療效果欠佳，導致腫瘤易復發且患者遠期生存率不高［1］。姜黃素是從中藥姜黃中提取的一種有效化學成分，大量研究證實其具有抗炎，抗氧化，抗腫瘤等多種生物學功能。有研究發現姜黃素對多種腫瘤細胞具有增殖抑制，促進凋亡，抑制血管生成等效應，然而其具體機制尚不清楚［2］。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)屬于腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族，與腫瘤細胞表面相應配體 DR4，DR5，DcR1，DcR2結合，發揮生物學功能且對正常的細胞無明顯抑制作用，是治療腫瘤一種具有良好前景的藥物［3-4］。本課題研究姜黃素聯合TRAIL對白血病U937細胞的凋亡的影響，同時觀察DR5的表達變化，旨為白血病的治療提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人白血病細胞株U937購自中國科學院上海細胞生物庫。姜黃素(美國 Sigma公司，純度 ＞99%);IMEM培養基、胎牛血清購于Gibco公司，MTT和二甲基亞砜(DMSO)購自碧云天公司，凋亡檢測試劑盒為貝博公司產品，DR5抗體購自BD公司，重組人TRAIL購自eBiosicence公司，流式細胞儀為BD公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 U937細胞株培養 在含10%胎牛血清、雙抗(100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1鏈霉素)的IMEM培養基中，于37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中培養，選取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 對細胞增殖抑制的檢測 采用常規MTT法，取對數生長期的U937，以2×104/孔細胞接種96孔板，加入終濃度為 5、10、20、40 μmol·L-1的姜黃素及 1、10、100、1 000 μg·L-1的TRAIL，同時設無細胞的空白對照孔，每組設3個復孔，繼續孵育24 h，繼續檢測前加入20μL的MTT，繼續在培養箱中孵育4 h，棄去上清，每孔加入150μL DMSO，室溫振蕩10 min，經酶標儀在490 nm波長檢測相應的吸光度(A)，抑制率 =(對照組 A值 -實驗孔 A值)/對照組 A值 ×100%。每組實驗重復3次，取平均值。

1.2.3 流式細胞儀檢測 收集處于對數生長期的U937細胞以109·L-1接種于6孔板，10μg·L-1的TRALL聯合加入姜黃素(5、10、20、40 μmol·L-1)，設不加藥組為對照組，每組設3個復孔，24 h后，收集各實驗組和對照組細胞，用PBS洗滌3次，調整細胞數至1010·L-1，加入3只離心管，每管100μL細胞懸液，分別加入5μL PI及10μL Annexin V的熒光抗體，避光孵育15 min，經流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.4 蛋白免疫印跡雜交 收集處于對數生長期的U937細胞，配成1011·L-1細胞懸液，接種于6孔板，10μg·L-1的TRALL聯合加入姜黃素(終濃度分別為10、20、40μmol·L-1)，設不加藥組為對照組，繼續培養24 h，收集U937細胞，用 PBS 洗滌 3 次，1 800 r·min-1離心 10 min，棄上清，細胞沉淀內加入強效細胞裂解液300μL和蛋白酶抑制劑3 μL，冰上裂解30 min，取上清置于EP管內，4℃ 12 000 g離心15 min，收集上清作為總蛋白，考馬斯亮藍定量試劑盒進行蛋白檢測，BCA法檢測蛋白濃度，雙蒸水配平，每管加入蛋白處理液30μL，混勻煮沸5 min，按每泳道蛋白樣品40 μg加入SDS-PAGE樣品孔內，電泳后半干電轉移至硝酸纖維膜上，一抗(鼠抗人DR5)、二抗孵育及顯色、掃描條帶，Imagel軟件分析灰度值。

1.3 統計分析 采用SPSS13.0統計軟件處理數據。實驗觀測資料，主要為計量資料，以±s表示，均行正態性檢驗。多組間均數比較采用單因素方差分析，多重比較方法為LSD檢驗。兩獨立組間的比較為成組t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 姜黃素、TRAIL對U937的作用結果 實驗結果顯示5～40μmol·L-1的姜黃素對U937有明顯的細胞增殖抑制作用，加藥組的增殖抑制作用顯著高于對照組(5μmol·L-1)，差異有統計學意義(P＜0.05)。不同濃度的 TRAIL作用24 h后，其對U937無明顯增殖抑制作用，與對照組(1 μg·L-1)比較，除最高的劑量組(B4)外，差異多無統計學意義(P＞0.05)。結果見表1。

表1 姜黃素及TRAIL對U937細胞的增殖抑制率(±s)

注:單因素方差分析。

A:姜黃素/μmol·L-1 24 h觀測值(n=9)B:TRAIL/μg·L-1 24 h觀測值(n=9)空白組 A0:0.0 0.5 ±0.1 B0:0.0 0.5 ±0.1對照組 A1:5.0 5.9 ±1.2 B1:1.0 4.6 ±1.8劑量組 A2:10.0 18.7 ±3.6 B2:10.0 5.6 ±2.4 A3:20.0 29.4 ±5.1 B3:100.0 6.9 ±2.9 A4:40.0 42.8 ±6.9 B4:1000.0 8.7 ±3.5整體分析:F，P 99.191，0.000 3.859，0.018多重比較 A2 vs A1 5.778，0.000 B2 vs B1 0.762，0.452:LSD-t，P A3 vs A1 10.558，0.000 B3 vs B1 1.803，0.081 A3 vs A2 4.780，0.000 B3 vs B2 1.041，0.306 A4 vs A1 16.574，0.000 B4 vs B1 3.208，0.003 A4 vs A2 10.796，0.000 B4 vs B2 2.446，0.020 A4 vs A3 6.016，0.000 B4 vs B3 1.405，0.170

2.2 流式細胞儀檢測U937細胞的凋亡率 U937細胞經1、10、100、1 000 μg·L-1的 TRAIL 作用24 h 無凋亡發生，5、10、20、40 μmol·L-1的姜黃素作用 24 h 的凋亡率分別為(4.7 ± 0.7)%、(9.8 ± 1.2)%、(15.6 ± 3.1)%、(24.8 ±4.5)%，10 μg·L-1的 TRAIL 聯合 5、10、20、40 μmol·L-1的姜黃素作用24 h的凋亡率分別為(15.6±1.5)%、(26.7±3.5)% 、(49.7 ±6.5)% 、(76.7 ±10.5)%，與相應單獨姜黃組比較有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 姜黃素單獨或聯合TRAIL對U937細胞的凋亡率(±s)

表2 姜黃素單獨或聯合TRAIL對U937細胞的凋亡率(±s)

注:姜黃素濃度如表中所示，TRIL濃度為10.0μg·L-1。比較方法為成組t檢驗。

n 對照組 5 μmol·L-1 10 μmol·L-1 20 μmol·L-1 40 μmol·L -1姜黃素94.3 ±0.5 4.7 ±0.7 9.8 ±1.2 15.6 ±3.1 24.8 ±4.5姜黃素 +TRAIL 9 4.7 ±0.6 15.6 ±1.5 26.7 ±3.5 49.7 ±6.5 76.7 ±10.5兩組相比 t，P 1.536，0.144 19.755，0.000 13.703，0.000 14.206，0.000 13.630，0.000

2.3 WB法檢測DR5表達率 10μg·L-1的TRALL聯合10、20、40 μmol·L-1的姜黃素作用 24 h 后的 U937 細胞，其DR5蛋白表達明顯上調，與空白對照組比較有明顯不同。參見圖1。

3 討論

白血病是造血干細胞因分化阻滯，凋亡障礙和惡性增殖而引起的一組異質性的造血系統惡性腫瘤，目前白血病的治療仍以化療為主，然而腫瘤的耐藥及較強的毒副作用使80%左右的患者復發［5］。

近年來，中醫藥在治療白血病方面取得了一定的療效。姜黃素使從姜科植物中藥姜黃的地下根莖中分離出來的具有廣泛生物活性的物質［6］。在實驗和臨床研究中發現其具有抗氧化，抗感染和抗腫瘤的生物學活性。研究證實姜黃素在體外可以協同5-氟尿嘧啶，全反式維甲酸，順鉑，塞來昔布，柔紅霉素等對結腸癌，胃癌，肝癌，宮頸癌，前列腺癌等多種細胞株具有協同殺傷效應［7-8］。大量研究證實姜黃素通過抑制NF-κB活性，抑制轉錄增殖相關基因(cyclin D1)，抗凋亡相關基因(XIAP，survivin)等抑制耐藥的多發性骨髓瘤細胞增殖，從而逆轉腫瘤的多藥耐藥(MDR)，為姜黃素單獨或聯合其它化療藥物逆轉MDR，減輕化療的不良反應提供了強有力的依據［9］。另有研究進一步證實姜黃素逆轉的MDR，可能是通過抑制腫瘤抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，恢復Smac蛋白的釋放，從而打開內源性凋亡途徑，經線粒體途徑誘導腫瘤細胞凋亡。本研究發現，姜黃素對白血病U937細胞具有明顯的增殖抑制及促凋亡作用，提示姜黃素單藥可能對多種腫瘤細胞具有溶瘤效應，為姜黃素在臨床中的使用提供了實驗依據。

TRAIL屬于腫瘤壞死因子家族，其與腫瘤細胞表面相應配體DR4，DR5，DcR1，DcR2結合啟動細胞信號傳導通路，在體外實驗中證實可以誘導多種腫瘤細胞株發生凋亡，且對正常的細胞無明顯抑制作用，是治療腫瘤一種具有良好前景的藥物。TRAIL與激活型受體DR4，DR5結合后，募集Fas相關死亡域蛋白(FADD)，procaspase-8形成死亡復合物，形成死亡誘導信號復合物(DISC)，最終激活下游caspase-3，誘導腫瘤細胞凋亡。誘騙受體DcR1和DcR2缺乏完整的胞內段，競爭性與TRAIL結合，抑制細胞凋亡［10］。研究發現在小細胞肺癌患者中，10.6%的患者DR5死亡結構域的基因發生突變，在頭頸部腫瘤中也驗證了同樣的改變，表明死亡受體的突變可能參與腫瘤的發生和進展。另有研究證實在某些對TRAIL抵抗的腫瘤細胞中，其表面激活型受體表達下調，誘騙型受體上調或細胞內抗凋亡蛋白(Bcl-2，c-FLIP等)的高表達，致其對TRAIL不敏感。我們的實驗也發現單獨TRAIL對U937細胞無任何毒性。因此，如何增敏TRAIL對腫瘤的殺傷研究尤為迫切。實驗中發現，低劑量TRAIL聯合不同濃度的姜黃素可顯著提高對腫瘤的殺傷，經流式細胞儀及免疫蛋白印跡法檢測后，發現經不同濃度的姜黃素作用24 h后的U937細胞，其表面及細胞內的DR5蛋白明顯上調，表明姜黃素增敏TRAIL對U937的殺傷可能是通過上調DR5而實現的。

綜上所述，TRAIL對惡性腫瘤的治療具有廣闊的前景，然而腫瘤細胞是否對其敏感將直接影響其療效，因此如何聯合其它藥物增敏腫瘤對其殺傷成為免疫細胞治療成功的關鍵。本研究證實中藥提取物姜黃素通過上調DR5可增加白血病U937細胞對TRAIL的敏感性，為臨床治療復發性白血病提供了新的思路，然而其協同作用機制仍需進一步研究。

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