廣西人群TGF-β1基因rs1800469 C／T遺傳多態性的研究

黃華佗 羅宏成 向陽 陳健明 吳成將 韋葉生

·論著·

廣西人群TGF-β1基因rs1800469 C／T遺傳多態性的研究

黃華佗 羅宏成 向陽 陳健明 吳成將 韋葉生★

目的研究轉化生長因子β1（TGF-β1）基因rs1800469C／T位點多態性各等位基因及基因型在廣西人群中的分布頻率，比較其在不同種族間的分布差異。方法采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性技術和DNA測序法檢測210例廣西人群TGF-β1基因rs1800469C／T位點多態性，并結合文獻進行不同種族間的比較分析。結果廣西人群中，TGF-β1基因rs1800469C／T位點表現出CC、CT、TT三種基因型，頻率分別為24.3％、49.5％、和26.2％，C、T等位基因型頻率分別為49.0％和51.0％。其基因型及等位基因頻率在男女間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。進一步將其分型數據與人類基因組計劃公布的4個人群和參考文獻中部分種族人群比較發現，廣西人群中，TGF-β1基因rs1800469C／T位點基因型及等位基因頻率與英國人、土耳其人、歐洲人（HapMap-CEU）和非洲人（HapMap-YRI）比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），而與日本人（HapMap-JPT）、北京漢族人（HapMap-HCB）、福州人和重慶漢族人比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。結論在廣西人群中存在TGF-β1基因rs1800469C／T位點多態性，其基因多態性的分布頻率差異無統計學意義，但與其他種族人群比較存在顯著差異。這種差異可能是導致一些疾病在不同種族人群間臨床表現及發病率存在較大差異的因素之一。

TGF-β1；基因多態性；種族

轉化生長因子-β1（TGF-β1）是轉化生長因子超家族中的一員，是由2條分子量為11KD，有112個氨基酸構成的單鏈通過二硫鍵結合而成，分子量為25 Kd的多肽。人類編碼TGF-β1的基因位于第19號染色體長臂（19q13.2）上，包含7個外顯子和6個內含子。該基因目前已發現的突變位點有十多個，而常見的與疾病有密切聯系的有7個，rs1800469C／T（-509C／T）是其中的一個重要的突變位點。該位點位于結構基因5′端上游的DNA序列啟動子區內。TGF-β1基因單核苷酸多態性與纖維硬化性疾病、腫瘤性疾病、免疫性疾病和糖尿病及其并發癥等疾病的發病密切相關，成為近年來國內外學者研究的熱點［1－6］。為此，我們用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性技術和DNA測序法檢測廣西人群TGF-β1基因rs1800469C／T位點單核苷酸多態，同時探討其基因多態性在正常人群間的分布差異，為與TGF-β1基因相關的疾病和遺傳學及預防醫學等方面的研究提供一些前瞻性基礎資料。

1 對象與方法

1.1 對象

研究對象共210例，其中男139例、女71例，平均年齡47.9歲±10.1歲，選自2013年1月至2014年8月右江民族醫學院附屬醫院體檢人群的隨機個體，年齡匹配，血脂、血常規和其他生化指標都在參考范圍內，心電圖檢查正常，均排除癌癥家族史、肝臟、腎臟、內分泌和心腦血管疾病。所有研究對象均為無血緣關系的廣西人群。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

用EDTA-K2抗凝管采集以上健康體檢者靜脈血3m L，參照我們已建立的改良碘化鈉法［7］提取白細胞基因組DNA，放于－70℃冰箱保存備用。

1.2.2 引物設計與合成

根據TGF-β1基因rs1800469C／T多態性和已知的DNA序列，用在線引物設計網站（http：／／www.yeastgenome.org／cgi-bin／web-primer）設計PCR引物，委托上海天昊生物科技有限公司合成。用于特異性擴增TGF-β1基因包含rs1800469C／T位點堿基的DNA片段的引物，上游引物序列為：5′-CAGACTCTAGAGACTGTCAG-3′，下游引物序列為：5′-GTCACCAGAGA AAGAGGAC-3′。

1.2.3 PCR擴增

TGF-β1 rs1800469C／T的PCR擴增反應體系為20μL，其中含10×PCR緩沖液2.0μL，0.3 mmol／L dNTPs 2.0μL，上、下游引物各1.0μL，模板DNA 1.0μL，TaqDNA聚合酶1.0 U，不足體積用滅菌雙蒸水補足至20μL。TGF-β1 rs1800469C／T的循環參數為：94℃預變性反應5m in；94℃變性30 s，63℃復性45 s，72℃延伸45 s，35個循環；72℃延伸8m in。

1.2.4 PCR擴增產物限制性酶切

TGF-β1 rs1800469C／T的擴增產物用2 U Bsu36 I于37℃酶切2 h；全部內切酶均來自英國Biolabs公司。TGF-β1 rs1800469C／T酶切產物于8％聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，染色后在紫外燈下鑒定結果，并用Bio-Rad自動凝膠成像及分析系統進行成像和分析。為進一步驗證結果，我們將PCR產物送上海英俊生物技術有限公司進行DNA序列測定。

1.3 統計分析

基因型和等位基因頻率采用直接計數法計算，各組間基因型及等位基因頻率的比較采用χ2檢驗，所有數據計算和比較均在SPSS 11.5軟件上完成。以P＜0.05作為差異具有統計學意義的參考。

2 結果

2.1 TGF-β基因rs1800469C／T位點基因型檢測結果

TGF-β1基因rs1800469C／T位點PCR擴增產物片段大小為419 bp，根據限制性內切酶Bsu36 I酶切片段的情況基因型有3種，CC型（229 bp，190 bp 2條帶），CT型（419 bp，229 bp，190 bp 3條

帶），TT型（419 bp 1條帶）；PCR擴增產物及酶切產物電泳結果分別如下圖1和圖2。基因測序進一步證實我們的結果（圖3）。

圖1 TGF-β1基因rs1800469C／T位點PCR擴增產物8％的聚丙稀酰胺凝膠電泳結果Figure 1 PCR amplified products of TGF-β1 gene rs1800469C／T in 8％polyacrylamide gel electrophoresis

2.2 廣西人群TGF-β1基因rs1800469C／T位點基因型和等位基因在男、女組間分布頻率的比較

計算廣西健康人群中TGF-β1基因和等位基因頻率，經χ2檢驗，TGF-β1基因rs1800469C／T位點基因型及等位基因頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，說明所選的研究樣本具有群體代表性。在廣西人群中TGF-β1基因rs1800469C／T位點基因型以CT型最為常見，占49.5％，其次為TT基因型。等位基因型頻率以T最高，占51.0％。其基因型和等位基因頻率分布在男女組間比較差異無統計學意義（P＞0.05，P1＝0.941，P2＝0.942。P1和P2分別表示男女間基因型和等位基因頻率比較的P值），結果如下表1。

圖2 TGF-β1基因rs1800469C／T位點多態性8％的聚丙稀酰胺凝膠電泳結果Figure 2 TGF-β1 gene rs1800469C／T polymorphism in 8％ polyacrylam ide gel electrophoresis

圖3 TGF-β1基因rs1800469C／T位點測序圖Figure 3 Sequencingmap of TGF-β1 gene rs1800469C／T

表1 廣西人群TGF-β1基因rs1800469C／T位點基因型和等位基因在男、女間分布頻率的比較（％）Table 1 Comparison of the frequency of genotype and allele distribution of TGF-1 gene rs1800469C／T betweenmale and female（％）

2.3 TGF-β1基因rs1800469C／T位點基因多態性在不同種族人群間的比較

廣西人群中TGF-β1基因rs1800469C／T位點基因型和等位基因頻率與英國人［8］、土耳其人［9］、歐洲人和非洲人比較，差異均有統計學意義（P＜0.05，基因型和等位基因頻率比較P值均小于0.001），但與日本人（P1＝0.335，P2＝0.222）、北京漢

族人（P1＝0.176，P2＝0.135）、福州人［10］（P1＝0.629，P2＝0.333）和重慶漢族人［11］（P1＝0.475，P2＝0.470）比較，差異均無統計學意義（P＞0.05。P1和P2分別表示廣西人群與不同國家和地區人群間基因型和等位基因頻率比較的P值）。結果如下表2。

表2 不同種族和地區人群間TGF-β1基因rs1800469C／T位點基因型及等位基因頻率的比較（％）Table 2 Comparison of the frequency of genotype and allele distribution of TGF-1 gene rs1800469C／T between different races and regions（％）

3 討論

分子生物學研究發現，基因多態是一種普遍的現象。隨著分子生物學技術的日新月異，人們對基因多態的認識有了突破性的進展，基因多態性的研究逐漸成為解釋人體對某些疾病或毒物的易感性與耐受性，疾病臨床表現的多樣性以及對藥物治療的反應性的內在機制。而在我們研究致病基因多態性分布之前，我們應該首先了解其在正常人群中的分布特點，這對我們探索某些致病基因和易感基因的分布特點，研究疾病的發病機理以及其在基因水平的診斷和治療上都有重要意義。

轉化生長因子-β1（TGF-β1）是轉化生長因子超家族中的一員，廣泛表達于多種細胞表面，包括活化的T細胞、B細胞和多數腫瘤細胞等細胞表面。TGF-β1可以通過調節淋巴細胞的增殖、分化，抑制NK細胞的增殖及殺傷等方式起到免疫抑制作用，這對于機體維持免疫內環境的穩定有著重要作用。然而，在病理情況下，TGF-β1通過其免疫抑制作用，損傷機體的免疫監督功能，使機體失去對自身抗原、腫瘤相關抗原和外來抗原的正常免疫應答，從而導致自身免疫性疾病或腫瘤的發生［12］。人類編碼TGF-β1的基因位于第19號染色體長臂（19q13.2）上，包含7個外顯子和6個內含子。分子生物學研究表明，TGF-β1基因存在rs1800469C／T位點單核苷酸多態性，這些基因多態性的存在可能影響TGF-β1基因的功能，從而可能導致與之相關疾病的發生和發展。TGF-β1基因存在多個單核苷酸多態性位點，國內外相關研究［1－6］發現，這些多態性位點與纖維硬化性疾病、腫瘤性疾病、免疫性疾病和糖尿病及其并發癥等疾病的發生和發展有著密切聯系，而rs1800469C／T是其中一個重要位點。因此，正確分析TGF-β1基因多態性在不同民族、國家和地區正常人群中的分布非常必要，其研究成果將為我們今后研究不同人群TGF-β1基因多態性和某些疾病的發生與發展之間的關系提供基礎理論依據和分子生物學及遺傳學基礎。

為此，我們采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性技術和DNA測序法檢測廣西地區正常人群TGF-β1基因rs1800469C／T位點多態性的分布情況。結果，在廣西人群中，TGF-β1基因rs1800469 C／T位點表現出CC、CT、TT三種基因型，頻率分別為24.3％、49.5％、和26.2％；等位基因C、T頻率分別為49.0％和51.0％。其基因型和等位基因頻率分布男女組間比較，差異無統計學

意義（P＞0.05）。進一步將檢測結果同英國人［8］、土耳其人［9］、歐洲人、非洲人、日本人、北京漢族人、福州人［10］和重慶漢族人［11］比較發現，廣西人群TGF-β1基因rs1800469C／T位點基因型和等位基因頻率與英國人、土耳其人、歐洲人和非洲人比較，差異均具有統計學意義（P＜0.05），與日本人、北京漢族人、福州人和重慶漢族人比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。而且廣西人群TGF-β1基因rs1800469C／T位點T等位基因頻率（51.0％）顯著高于英國人（32.0％）、歐洲人（28.8％）和非洲人（20.8％）。從本文結果可以發現，TGF-β1基因rs1800469C／T位點基因型和等位基因頻率在不同種族間比較，存在著明顯的差異，而與同一種族不同人群比較差異較小。這一結果符合“親緣關系越近，其基因型分布越相似，反之則差異越顯著”的遺傳學規律。

總之，研究我國廣西人群中TGF-β1基因多態性的分布，不僅為今后進一步研究我國廣西人群TGF-β1基因多態性與相關疾病發生和發展之間供理論依據，而且，將有助于我們更深入地理解這些疾病在廣西人群的遺傳基因背景，為后續的群體遺傳學和預防醫學研究提供前瞻性資料。

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The genetic polymorphism of TGF-β1 gene rs1800469C/T in Guangxipopulations

HUANG Huatuo,LUO Hongcheng,XIANG Yang,CHEN Jianming,WU Chengjiang,WEIYesheng★
(Department of Laboratory Medicine,Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities, Baise,Guangxi,China,533000)

Objective Based on the study of the frequencies of allele and genotype distribution of TGF-β1 gene rs1800469C/T polymorphism in Guangxi populations,to analyze the distributions of TGF-β1 rs1800469 C/T polymorphism among different races.Methods The TGF-β1 gene rs1800469C/T polymorphism was exam ined by the polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism methods in 210 Guangxi populations and compared w ith other ethnics.Results The TGF-β1 gene rs1800469C/T showed three genotypes of CC,CT,TT,and the frequencies were 24.3％,49.5％and 26.2％,respectively. Its allele frequencies of C and T were 49.0％and 51.0％,respectively.The frequencies of allele and genotype distribution of TGF-β1 gene rs1800469C/T were no statistical significance between men and women in Guangxi populations(P＆gt;0.05).Compared w ith British,Turks,HapMap-CEU and HapMap-YRI populations, the TGF-β1 gene rs1800469C/T polymorphism were in statistical significance(P＆lt;0.05).But compared with HapMap-JPT,HapMap-HCB,Fuzhou and Chongqing Han populations,there were no statistical significance (P＆gt;0.05).Conclusion There are TGF-β1 gene rs1800469 C/T polymorphism in Guangxi populations,and its distributions has no statistical significance between men and women in Guangxi populations.Whose distri-

TGF-β1；Polymorphism；Ethnic

國家自然科學基金（81260234，81060243，81560552）

右江民族醫學院附屬醫院檢驗科，廣西，百色533000

★通訊作者：韋葉生，E-mail：wysh22＠163.com

butions are significant difference compared w ith others ethnic populations.The variation of TGF-β1 gene polymorphism among different ethnic groupsm ight account for the varied clinical spectrum of some TGF-β1 gene related diseases.