Soleris檢測技術在生乳細菌總數快速測定中的應用

文∕何 瑛 林木娣 吳 騰 邢益俊

（廣東燕塘乳業股份有限公司檢測中心）

牛奶富含多種營養物質，被稱為“白色血液”，是為數不多的全價食品之一，也是微生物生長繁殖的良好培養基，一旦與外界接觸就極易受到污染，細菌總數是其衛生質量的重要監控指標。

國標GB 19301—2010規定，當生乳中細菌總數達到2×106CFU/mL時，牛奶的質量安全就會受到威脅，此時生乳不允許用作原料乳。生乳的細菌總數與乳制品后期生產加工及儲存密切相關，細菌總數過多，生乳容易發生酸敗，導致保質期縮短、蛋白質熱穩定性下降而無法加工或者在加工過程中需要更苛刻的條件才能達到滅菌效果，不僅破壞了牛奶的營養成分，還可能由于滅菌不完全帶來潛在質量問題。此外，生乳中大量的細菌生長繁殖極易產生耐熱性的酶及毒素，它們經超高溫處理后仍有殘留，容易引起UHT產品在貨架期內變質或導致消費者中毒事件發生[1]。

檢測生乳中細菌總數的方法很多，傳統的平板計數法是應用最廣泛的，但該法需48 h才能完成菌落計數，不能及時把握原料乳的衛生質量狀況。近年來，細菌總數的快速檢測技術得到了很大的發展，如電化學阻抗法[2]、ATP生物發光法[3]、流式細胞計數法[4]、還原法[5]、微生物自動檢測儀等[6]。Soleris實時光電微生物快速檢測系統是一種新興的微生物自動檢測技術，它基于傳統的培養基理論和染色技術，并結合了光電檢測技術和計算機控制的模塊化分析系統研發而成，被UPS推薦為替代傳統平板的有效方法之一，在國外已成功應用于液態奶中微生物的檢驗[7]。本文參照國標GB 4789.2—2010方法和Soleris方法進行同步實驗，研究建立Soleris系統快速檢測生乳中細菌總數的方法模型，為生乳細菌總數的測定提供了一種簡單、快速、準確的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 生乳

采自廣東、福建、廣西等地的大型奶牛場。

1.1.2 試劑

平板計數瓊脂（PCA，北京陸橋），0.85%滅菌生理鹽水，Soleris細菌總數試劑瓶（美國Neogen公司）。

1.1.3 儀器設備

移液槍（德國Brand），渦旋振蕩器（海太牌），恒溫培養箱（上海一恒）；

Soleris實時光電微生物快速檢測系統，美國Neogen公司生產，可內置128個試劑瓶，光電檢測器每隔6 min監測試劑瓶底部瓊脂栓的顏色變化并傳輸到計算機。

1.2 方法建立

1.2.1 工作原理

Soleris系統在預制的試劑瓶中放入營養培養基（內含以葡萄糖為碳源的蛋白胨酵母抽提物）和pH值指示劑（溴甲酚紫），在35℃培養環境下，樣品中的細菌在Soleris試劑瓶中增殖，分解葡萄糖產酸使pH值改變，繼而引起指示劑顏色的變化，通過系統自帶的光電系統監測試劑瓶底部瓊脂栓顏色發生改變的時間來計算樣品的細菌數。

1.2.2 標準曲線的制備

本實驗將取自各地牧場的細菌數各異的生乳樣品，按照GB 4789.2—2010的方法[8]選擇合適的稀釋度進行平板培養，同時取1 mL樣品原液加入Soleris菌落總數檢測試劑瓶中，上機檢測。國標方法獲得樣品細菌總數（CFU/mL），Soleris儀器獲得相應的瓊脂栓變色時間（DT），由此建立細菌總數和DT之間的對應關系，剔除偏離回歸曲線較大的點，制成標準曲線用于樣品的定量檢測。

1.2.3 儀器重復性試驗

選取細菌數在不同數量級的樣品，標號為A1～A9，使用Soleris系統分別重復測定3 次，將得到的結果進行統計學分析，相對標準偏差用RSD表示。

1.2.4 標準曲線的驗證

調試儀器處于正常的檢測狀態，隨機選取不同時期各奶牛場的生乳樣品不少于30個，同時按照Soleris儀器法和國標平板計數法對樣品細菌總數進行檢測，記錄儀器檢出時間（DT），將DT值代入標準曲線中得到儀器菌落數，與對應的平板法菌落總數進行比較，并對2 組數據進行統計學分析。

2 結果與討論

2.1 標準曲線的建立

選取來自廣東、福建、廣西等地牧場的生乳樣品共102個，將樣品在Soleris儀器上測得的指示劑變色時間（DT）設為橫坐標，國標平板計數法測得的細菌總數結果（CFU/mL）取對數值（Log CFU）后設為縱坐標，得到Log CFU與DT值之間的標準曲線如圖1所示。

對Soleris儀器法與國標法的結果進行回歸分析，得到生乳細菌總數檢測標準曲線為：Log CFU＝7.634－0.472×DT，相關系數R2＝－0.93，表明2 種方法所得結果具有較好的相關性，相關系數為負數，即細菌數與DT值為負相關，細菌數越高檢測時間越短，有利于加快企業對高污染生乳樣品的預警。

由標準曲線可得，國標生乳細菌總數的限量水平為2×106CFU/mL，DT值約為2.8 h；若設定生乳細菌總數低于5×105CFU/mL，DT值約為4.1 h；當生乳細菌數低至103CFU/mL[1]時，DT值約為9.8 h，同國標方法完成菌落計數所需48 h相比，Soleris方法可以大大縮短檢測時間。

圖1 生乳細菌總數檢測標準曲線

2.2 Soleris 儀器法重復性實驗

隨機選取生乳樣品9個，編號為A1～A9，使用Soleris系統分別重復測定3 次，得到的數據見表1。該方法測得數據的RSD值均在5%以內，表明儀器檢測結果的重復性良好。

2.3 標準曲線的驗證

為了驗證標準曲線的合理性，隨機抽取各奶牛場生乳樣品51 批次進行Soleris儀器法檢測，得出DT值代入標準曲線方程求出細菌總數，同時進行國標法平板計數，驗證結果見表2。由于微生物檢測存在一定的誤差，2 種方法測得結果的對數值可接受偏差范圍為±0.5，由表2可以看出，2 組對數值偏差的絕對值均小于0.5。認為標準曲線的準確度達到檢測要求；對2 組細菌總數作t檢驗，t＝1.869＜t0.05/2.50=2.009（P＜0.05），表明2 組數據之間沒有顯著性差異，Soleris法可以滿足生乳中細菌數檢測的定量要求。

3 總結

表1 儀器法重復性實驗（n ＝3）

3.1 本實驗建立了Soleris儀器法快速檢測生乳中細菌總數的方法模型，該方法操作簡便、實時快速，可進行批量檢測，與國標法有較好的一致性，重復性良好且自動化程度高，能有效避免人為誤差，對于生乳細菌總數檢測具有良好的適應性，為企業快速評估生乳的衛生質量狀況、指導生產、控制產品質量安全提供了決策依據。

3.2 Soleris法使用的關鍵是建立一條覆蓋面廣、具有代表性的標準曲線。曲線的相關系數不僅取決于2個方法之間的相關性，更與參與分析的樣品數量、樣品細菌數范圍、傳統平板計數結果的準確性等因素息息相關。隨著分析樣品數量的增加，樣品細菌數范圍覆蓋5～6個指數級，標準曲線描述的2 種方法之間的關系就越可靠，因此在日常檢驗的過程中應不斷添加新數據以完善標準曲線。

3.3 由于各奶牛場奶牛品種、飼養條件、環境衛生等的差異，污染生乳的細菌來源復雜，不同牧場的生乳樣品菌相不盡相同，對于標準曲線的適用性也有一定的差異，當需要檢測新來源的生乳樣品時，需要通過驗證實驗對曲線進行校正或者重新制作標準曲線。

表2 標準曲線驗證結果

[1]汪銀鋒，李素平，高騰云，等.原料乳衛生指標與質量關系的研究.江西農業學報，2009，21（8）：147-149.

[2]易敏英，李志勇.電阻抗法快速檢測鮮牛奶中細菌總數.中國乳品工業，2001，29（3）：30-31.

[3]李春艷，霍貴成，王德國，等.ATP生物發光法快速測定生乳中微生物總數的研究.食品工業科技，2008，29（7）：233-238.

[4]王寧，劉寧.流式細胞術快速檢測生乳中細菌總數.食品工業科技，2007，28（9）：197-200.

[5]富鑫，田雨，管勇佳，等.生乳細菌總數檢測儀測定生乳細菌總數的應用.食品工業科技，2012，33（2）：70-72.

[6]孔麗娜，李祖明，吳聰明，等.生乳微生物快速檢測技術研究進展.食品研究與開發，2013，34（24）：268-271.

[7] 北京安普生化科技有限公司.Soleris系統在乳制品微生物快速檢測領域的應用.食品安全導刊，2012（7）：34-35.

[8]中華人民共和國衛生部.GB 4789.2-2010 食品微生物學檢驗 菌落總數測定.北京：中國標準出版社，2010.