北京地區(qū)荷斯坦牛白細(xì)胞黏附缺陷癥的檢測(cè)分析

文∕楊宇澤 馮 濤 肖 煒 靳月生 路永強(qiáng)

（1北京市畜牧總站；2北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所；3北京市昌平區(qū)農(nóng)業(yè)局）

牛白細(xì)胞黏附缺陷癥（Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency，BLAD）是一種發(fā)生在荷斯坦牛群中的遺傳性免疫缺陷病，是一種由常染色體上單基因控制的隱性遺傳疾病。患病牛只臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重的重復(fù)性感染、膿液形成減少、傷口愈合延遲和白細(xì)胞增多，也表現(xiàn)為犢牛初生重低和發(fā)育不良等癥狀。BLAD最早由Hagemoser等[1]發(fā)現(xiàn)，該病在日本、美國(guó)、丹麥、荷蘭、德國(guó)、瑞士、土耳其、中國(guó)[2，3]、印度[4]、捷克[5]等國(guó)均有發(fā)生。

BLAD是由于牛1號(hào)染色體上編碼整合素β亞單位（CD18）的第383位堿基由A突變?yōu)镚，使與之相應(yīng)的位于胞外高度保守區(qū)的第128位天門冬氨酸變成了甘氨酸，最終導(dǎo)致白細(xì)胞表面整合素的β2亞單位表達(dá)明顯減少或缺乏而引起的臨床發(fā)病。該突變導(dǎo)致CD18基因上TaqI酶切位點(diǎn)的消失。據(jù)此，通過(guò)檢測(cè)北京郊區(qū)荷斯坦母牛CD18A383G基因型，為進(jìn)行遺傳改良和淘汰含BLAD基因的奶牛個(gè)體提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采集北京市延慶縣A奶牛場(chǎng)、B奶牛場(chǎng)及昌平區(qū)C奶牛場(chǎng)共502 份健康荷斯坦母牛抗凝血樣，利用血液基因組提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）抽提血液基因組DNA。

1.2 方法

根據(jù)Genbank中牛CD18（NM_175781）基因序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列為：F：5′-CAGGTCAGGCAGTTGCGTTCAAT-3′；R：5′-GGTTTCAGGGGAAGATGGA GTAG-3′。PCR產(chǎn)物大小206 bp，位于CD18基因第二外顯子區(qū)。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，64 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

對(duì)502 份荷斯坦母牛血液基因組DNA 進(jìn)行PCR 反應(yīng)，對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行酶切，經(jīng)Taq I（Takara）酶切后理論上可以呈現(xiàn)3 種基因型，即野生型（AA）150/56 bp、雜合型（AG）206/150/56 bp和突變型（GG）206 bp。酶切后的雜合型和突變型個(gè)體全部經(jīng)PCR產(chǎn)物測(cè)序再次確認(rèn)，以確保結(jié)果準(zhǔn)確無(wú)誤。

2 結(jié)果

在檢測(cè)的3 個(gè)奶牛場(chǎng)中，延慶A奶牛場(chǎng)未檢測(cè)到攜帶BLAD基因的個(gè)體；延慶B奶牛場(chǎng)中檢測(cè)到2頭攜帶BLAD雜合基因個(gè)體；昌平C奶牛場(chǎng)中檢測(cè)到3 頭攜帶BLAD基因的雜合個(gè)體。雜合子個(gè)體PCR產(chǎn)物序列測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1，圖中最中間的堿基測(cè)序圖呈現(xiàn)2 個(gè)明顯的波峰，其中綠色的峰代表A堿基，黑色的峰代表G堿基，即表示在該位點(diǎn)為雜合子突變。在3 個(gè)奶牛場(chǎng)中共檢測(cè)到2 種基因型，AA和AG，未檢測(cè)到GG基因型。檢測(cè)群體中BLAD基因的攜帶率為3.1%。圖2為荷斯坦牛CD18基因PCR-RFLP檢測(cè)的瓊脂糖凝膠電泳圖。表1為3 個(gè)奶牛場(chǎng)奶牛BLAD基因頻率統(tǒng)計(jì)分析。

圖1 AG 雜合子個(gè)體PCR 產(chǎn)物序列測(cè)定結(jié)果

圖2 荷斯坦牛CD18 基因PCR-RFLP 檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳圖

表1 3 個(gè)奶牛場(chǎng)奶牛BLAD 基因頻率統(tǒng)計(jì)分析

3 討論

牛白細(xì)胞黏附缺陷癥（BLAD）純合子基因突變可導(dǎo)致?tīng)倥Ｔ缙谒劳觯瑖?yán)重影響了奶牛的育種生產(chǎn)成本，降低了奶牛生產(chǎn)效率。但由于該突變基因?yàn)殡[性遺傳，一般常規(guī)的方法無(wú)法確定病癥。因此，用分子檢測(cè)手段對(duì)奶牛群進(jìn)行牛白細(xì)胞黏附缺陷癥（BLAD）突變基因檢測(cè)尤為重要。

李艷華等[2]檢測(cè)了北京市荷斯坦公牛BLAD基因，發(fā)現(xiàn)了1 頭BLAD基因攜帶者，BLAD基因的檢測(cè)率為1.9%（1/54）。王洪梅等[3]檢測(cè)了濟(jì)南市周邊11 個(gè)奶牛場(chǎng)356 頭荷斯坦母牛和山東奧克斯荷斯坦奶牛公牛站的53 份公牛凍精，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有3 頭母牛攜帶BLAD基因，檢出率為0.8%，公牛均不攜帶BLAD基因。王洪梅等[6]對(duì)天津和山東的荷斯坦母牛進(jìn)行了檢測(cè)，BLAD基因的攜帶率為0.69%（3/436）。近期，李艷華等[7]檢測(cè)了北京奶牛中心246 頭荷斯坦公牛和北京地區(qū)高產(chǎn)奶牛群409 頭母牛，結(jié)果發(fā)現(xiàn)公牛群BLAD基因攜帶率為0.41%，母牛群BLAD基因攜帶率為3.91%。

綜合以上研究可以看出，北京市荷斯坦牛群體中公牛BLAD基因的攜帶率較六七年前有所降低，但還沒(méi)有達(dá)到徹底凈化的程度，特別是在母牛群中，攜帶者頻率長(zhǎng)期達(dá)到3.0%以上。此外，本研究中荷斯坦母牛BLAD基因攜帶率與李艷華等[7]研究結(jié)果相似，說(shuō)明在京郊地區(qū)規(guī)模化奶牛場(chǎng)使用的公牛凍精中BLAD基因沒(méi)有得到徹底凈化，導(dǎo)致母牛群體中BLAD基因攜帶率在3%以上。所以在奶牛育種和生產(chǎn)中，應(yīng)有計(jì)劃地淘汰攜帶BLAD基因的個(gè)體，凈化京郊荷斯坦牛群體。

[1]Hagemoser W A，Roth J A，Lofstedt J，et al.Granulocytopathy in a Holstein heifer.J Am Vet Med Assoc，1983，183（10）：1093-1094.

[2]李艷華，張勝利，韓廣文，等.利用單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)牛白細(xì)胞黏附缺陷癥方法的建立.遺傳，2007，29（12）：1471-1474.

[3]王洪梅，李建斌，高運(yùn)東，等.中國(guó)荷斯坦牛白細(xì)胞黏附缺陷癥基因檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用.河北保定：中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物繁殖學(xué)分會(huì)第十三屆學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集.2006：417-420.

[4]Patel R K，Singh K M，Soni K J，et al.Low incidence of bovine leukocyte adhesion deficiency（BLAD）carriers in Indian cattle and buffalo breeds.J Appl Genet，2007，48（2）：153-155.

[5]Citek J，Rehout V，Schr?ffelová D，et al.Frequency of BLAD and CVM alleles in sires and elite heifers of Czech Holstein cattle.Dtsch Tierarztl Wochenschr，2008，115（12）：475-477.

[6]李艷華，朱玉林，張勝利，等.北京地區(qū)荷斯坦牛BLAD遺傳缺陷基因的分子篩查.中國(guó)奶牛，2013（1）：17-20.

[7]王洪梅，李建斌，許尚忠，等.中國(guó)荷斯坦牛白細(xì)胞黏附缺陷癥PCRRFLP檢測(cè).生物技術(shù)通報(bào)，2007（3）：155-159.