老齡帕金森病模型小鼠氧化應激相關基因的表達差異

馬曉偉，張忠霞，王彥永，李曉麗，王銘維

老齡帕金森病模型小鼠氧化應激相關基因的表達差異

馬曉偉，張忠霞，王彥永，李曉麗，王銘維

目的探討老齡帕金森病（PD）模型小鼠行為學改變及黑質紋狀體系統氧化應激相關基因的表達差異。方法

老齡；帕金森病；氧化應激；SAMP8；MPTP

1 材料與方法

1.1 實驗動物SAMP8小鼠，雌性，10月齡，共16只，26～30 g，清潔級，由香港中文大學解剖學系惠贈。

1.2 主要試劑與儀器MPTP（美國Sigma公司）；TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）；RNeasy Mini Kit；RT2 First Strand Kit；RT2 SYBR Green Master Mix

（美國QIAGEN公司）；Real-time PCR Array（Mouse Oxidative Stress and Antioxidant Defense；PAMM-065A；美國SABiosciences公司）；A7500實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；Nanodrop ND-1000紫外分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）；5417R超低溫離心機（德國eppendorf公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組與給藥 按隨機數字表法將小鼠隨機分為生理鹽水對照組（8只）和模型組（8只）。模型組小鼠背部皮下注射MPTP，連續注射4次，每次14 mg／kg，每次間隔2 h。對照組每次均注射等體積無菌生理鹽水。于第1次注射72 h進行行為學測試后處死。

1.3.2 行為學檢測 用藥后72 h對兩組小鼠進行行為學測試，采用懸尾實驗檢測其運動功能。實驗方法同文獻［6］描述。實驗在隔音、安靜的房間進行。將小鼠倒置懸掛于實驗箱中（長×寬×高為30 cm×25 cm×25 cm，懸掛鼠尾的吊鉤距離鼠尾15 mm，通過一連接裝置與鼠尾相連），與實驗箱連接的電腦分析系統記錄5 min內小鼠的靜止時間。

本算法共實現高壓開關絕緣3種狀態的識別,分別為正常態,電暈態和高壓放電態[11]。設G1為電暈態的語料,其中包含C11～C1J1共J1條語料,將每條語料分幀,則電暈態共有P1=J1×MJ1幀(MJ1為每條語料的幀數);然后,對每幀語料訓練得到GMM模型,可得對應的GMM參數。同理,其他狀態的GMM參數也可以得到。這些參數在后續的識別過程中用于識別高壓開關柜正常態,電暈態和高壓放電態3種狀態。

1.3.3 DA水平的檢測 各組取4只小鼠處死，冰上迅速剝離出中腦黑質部分，加入遇冷的高氯酸進行勻漿，低溫離心機中4℃離心30 min，10 000 r／min，取上清液，采用高效液相-電化學法（HPLCECD）檢測DA含量。電化學檢測器的工作電壓為0.7 V，進樣量為20 μl，流速為0.6 ml／min。

1.3.4 PCR Array檢測 氧化應激和抗氧化PCR芯片共有84個基因，包括抗氧化基因、ROS代謝基因和氧運載基因。首先將小鼠迅速斷頭取腦，在冰上剝離出紋狀體組織，電子天平稱重后即刻使用RNeasy Mini Kit提取紋狀體組織的RNA，微量分光光度計測定RNA濃度及質量；使用RT2 First Strand Kit將1 000 ng RNA逆轉錄為單鏈cDNA；使用小鼠氧化應激及抗氧化聚合酶鏈反應產物序列分析（Mouse Oxidative Stress and Antioxidant Defense RT2 Profiler PCR Array），檢測模型組及對照組老齡SAMP8小鼠氧化應激相關基因的差異表達。PCR Array結果使用SABiosciences PCR Array數據分析Excel模板進行分析，上調或下調水平2倍及以上的基因為有意義。

1.4 統計學處理采用SPSS 13.0軟件進行分析，實驗數據以±s表示，兩組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 懸尾實驗結果與對照組相比，模型組小鼠懸掛的靜止時間明顯延長，差異有統計學意義（t＝11.27，P＜0.01）。見圖1。

2.2 DA水平的改變與對照組相比，模型組小鼠在注射MPTP后72 h DA水平下降了81.67%，差異有統計學意義（t＝16.86，P＜0.01）。見圖2。

2.3 氧化應激相關基因的表達PCR Array結果顯示：與對照組相比，模型組小鼠嗜酸粒細胞過氧化物酶（eosinophil peroxidase，EPX）、生長因子受體結合蛋白2相關結合蛋白1（growth factor receptor bound protein 2-associated protein 1，GAB1）、谷胱甘肽過氧化物酶3、6、8（glutathione peroxidase 3，6，8，GPX3，6，8）、乳酸過氧化物酶（lactoperoxidase，LPO）、肌紅蛋白（myoglobin，MB）、膜蛋白棕櫚酰化4（membrane protein palmitoylated 4，MPP4）、神經珠蛋白（neuroglobin，NGB）、核氧化還原蛋白（nucleoredoxin，NXN）、過氧化物氧化還原酶1（peroxiredoxin 1，PRDX1）、溶質運載蛋白家族41成員3（solute carrier family 41 member3，SLC41A3）12種基因分別依次下調4.32、2.01、3.37、2.74、2.68、2.85、3.44、2.38、2.23、2.32、4.29及2.11倍；可誘導型一氧化氮合酶2（inducible Nitric oxide synthase 2，iNOS2）、煙酞胺腺嘌呤二核苷酸磷酸環氧化酶（nicotinamideadeninedinucleotidephosphate-oxidase，NOX）及環氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）基因分別上調2.57、2.01及8.61倍。見表1。

3 討論

MPTP是廣泛用于PD研究的神經毒素，因其高親脂性可以迅速通過血腦屏障進入大腦，之后在單胺氧化酶B的作用下于神經膠質細胞中轉變為MPP＋，在細胞膜上多巴胺轉運體（DAT）的作用下進入DA能神經元，之后聚集在突觸小泡中，抑制線粒體內電子呼吸鏈的傳遞，損傷復合體Ⅰ的功能，導致中腦ATP水平下降，細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）與活性氮自由基（reactive nitrogen species，RNS）產生增多，引起氧化應激的發生［7］與DA能神經元的損傷。

本實驗在應用MPTP的基礎上，選用生長周期快并具有老化特征的10月齡SAMP8小鼠用于老齡PD模型的制作，結合毒素與衰老兩種致病因素，對于PD病理機制的研究比使用傳統小鼠模擬PD更具優勢。為了明確PD模型是否制作成功，本實驗在給模型組小鼠注射MPTP之后，檢測其中腦黑質的DA含量并進行懸尾實驗。懸尾實驗是一種經典而又能快速評價藥物毒性或藥效的方法，研究者在MPTP干預的PD模型鼠中，通過評測其懸尾實驗中靜止的持續時間來反映小鼠黑質紋狀體系統DA能神經元的退行性變，認為靜止時間的延長是PD模型小鼠運動障礙的結果［6-8］。本實驗結果發現其中腦的DA含量下降81.67%，懸尾實驗中靜止時間增加了85.7%，證實老齡SAMP8對于MPTP的易感性，復制老齡PD模型成功。

PCR Array結果顯示，與氧化應激相關的基因在mRNA水平發生改變。與對照組相比，模型組共有12種基因的改變超過2倍，其中3種上調，9種下調。ROS與RNS是體內主要的兩種自由基。NOX是生成ROS的主要酶體［9］，iNOS2可催化合成RNS及NO，二者在模型組小鼠分別上調了2.01倍和2.57倍；COX-2通過產生活性氧將體內的DA氧化為有活性的DA-醌類，使α-突觸核蛋白聚集，之后導致PD的病理性標志物路易小體的形成［10］，臨床已使用其抑制劑治療PD［11］，本結果顯示其水平顯著上調。

氧化應激反應增強的同時，抗氧化防御體系功能下降。GPX是生物體內重要的抗氧化酶之一，通過促進過氧化氫及脂質過氧化物的分解，保護細胞膜的結構及功能［12］。本研究中GPX3、6、8分別下降了3.37倍、2.74倍和2.68倍，反映出機體抗氧化應激能力的下降。PRDX1通過硫氧還蛋白還原過氧化物或超氧化物，消除代謝產生的過氧化物［13］，結果顯示其表達下調了4.29倍。NXN在氧化應激狀態下可與其相結合的DvI蛋白解離，激活下游的Wnt信號通路影響細胞狀態與功能。LPO可抑制脂質過氧化，清除羥基自由基并具有抗菌活性［14］。此外，還有肌紅蛋白、促紅細胞生成素、神經珠蛋白等幾種基因表達均下調2倍以上。

綜上所述，本研究顯示，老齡PD模型小鼠在急性損傷后72 h，氧化應激相關基因發生差異性改變，促氧化反應的基因上調，抗氧化基因下調，氧化應激系統與抗氧化應激體系二者的失衡導致機體病理生理的改變。相關基因的明確為以后臨床尋找輔助診斷指標與治療靶點提供依據。

［1］ Morley J E，Armbrecht H J，Farr S A，et al.The senescence accelerated mouse（SAMP8）as a model for oxidative stress andAlzheimer＇s disease［J］.Biochim Biophys Acta，2012，1822（5）：650－6.

［2］ Liu J，Wang M W，Gu P，et al.Microglial activation and age-related dopaminergic neurodegeneration in MPTP-treated SAMP8 mice［J］.Brain Res，2010，1345：213－20.

［3］ Zaitone S A，Hammad L N，Farag N E.Antioxidant potential of melatonin enhances the response to L-dopa in 1-methyl 4-phenyl 1，2，3，6-tetrahydropyridine-parkinsonian mice［J］.Pharmacol Rep，2013，65（5）：1213－26.

［4］ Kosloski L M，Kosmacek E A，Olson K E，et al.GM-CSF induces neuroprotective and anti-inflammatory responses in 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine intoxicated mice［J］.J Neuroimmunol，2013，265（1－2）：1－10.

［5］ Rekha K R，Selvakumar G P，Santha K，et al.Geraniol attenuates α-synuclein expression and neuromuscular impairment through increase dopamine content in MPTP intoxicated mice by dose dependent manner［J］.Biochem Biophys Res Commun，2013，440（4）：664－70.

［6］ Kida K，Yamada M，Tokuda K，et al.Inhaled hydrogen sulfide prevents neurodegeneration and movement disorder in a mouse model of Parkinson’s disease［J］.Antioxidants Redox Signal，2011，15（2）：343－52.

［7］ Ahn E H，Kim D W，Shin M J，et al.PEP-1-ribosomal protein S3 protects dopaminergic neurons in an MPTP-induced Parkinson′s disease mouse model［J］.Free Radic Biol Med，2013，55：36－45.

［8］ Mori A，Ohashi S，Nakai M，et al.Neural mechanisms underlying motor dysfunction as detected by the tail suspension test in MPTP-treated C57BL／6 mice［J］.Neurosci Res，2005，51（3）：265－74.

［9］ Hernandes M S，Café-Mendes C C，Britto L R.NADPH oxidase and the degeneration of dopaminergic neurons in parkinsonian mice［J］.Oxid Med Cell Longev，2013，2013：157857.

［10］Rubattu S，Mennuni S，Testa M，et al.Pathogenesis of chronic cardiorenal syndrome：is there a role for oxidative stress？［J］.Int J Mol Sci，2013，14（11）：23011－32.

［11］Akula K K，Dhir A，Kulkarni S K.Rofecoxib，a selective cyclooxygenase-2（COX-2）inhibitor increases pentylenetetrazol seizure threshold in mice：possible involvement of adenosinergic mechanism［J］.Epilepsy Res，2008，78：60－70.

［12］Cojocaru I M，Cojocaru M，Sapira V，et al.Evaluation of oxidative stress in patients with acute ischemic stroke［J］.Rom J Intern Med，2013，51（2）：97－106.

［13］Kruzel M L，Actor J K，Zimecki M，et al.Novel recombinant human lactoferrin：differential activation of oxidative stress related gene expression［J］.J Biotechnol，2013，168（4）：666-75.

［14］Funato Y，Miki H.Redox regulation of Wnt signalling via nucleoredoxin［J］.Free Radic Res，2010，44（4）：379－88.

Oxidative stress related gene expression difference in aging Parkinson’s disease model mice

Ma Xiaowei，Zhang Zhongxia，Wang Yanyong，et al
（Dept of Neurology，The First Hospital of Hebei Medical University，Brain Aging and Cognitive Neuroscience Laboratory，Shijiazhuang 050031）

ObjectiveTo explore the behavior changes and oxidative stress related gene expression difference in nigro-striatal system of aging Parkinson’s disease model mice.MethodsSenescence-accelerated mouse prone 8（SAMP8）aged 10-month old in sum of 16 were randomly divided into control group and model group.Acute injury was made by subcutaneous injections of 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine（MPTP）to mice in model group，while a corresponding volume of saline was given to the control.72 hours after injection，all the animals were tested by the behavioral test.Dopamine（DA）contents in nigro were measured by a high performance liquid chromatography with electochemical detector，and the oxidative stress related genes expression was detected by polymerase chain reaction array（PCR Array）.ResultsCompared with the control group，the DA levels and behavioral performance were both remarkably decreased in model group（P＜0.01）.Cyclooxygenase-2，inducible Nitric oxide synthase 2，reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate（NADPH）oxidase were up-regulated，while 9 genes such as glutathione peroxidase 3，6，8 were all down-regulated significantly（fold change＞2）.ConclusionUp-or down-regulation of oxidative stress related genes may result in the occurence of oxidative stress in aging PD model mice.

aging；Parkinson′s disease；oxidative stress；SAMP8；MPTP

R 742.5

1000－1492（2015）01－0029－04

2014－09－24接收

河北省醫學科學研究重點課題計劃（編號：20110302、20130272）

河北醫科大學第一醫院神經內科，河北省腦老化與認知神經科學實驗室，石家莊 050031

馬曉偉，女，碩士，副主任醫師；王銘維，女，教授，主任醫師，博士生導師，責任作者，E-mail：wmw＠hebmu.edu.cn

10月齡快速老化P8系（SAMP8）小鼠16只，隨機均分為對照組和模型組。模型組小鼠背部皮下注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）制成急性損傷模型，對照組小鼠給予同量生理鹽水。給藥后72 h進行行為學測試，高效液相色譜法檢測黑質多巴胺（DA）含量，PCR Array檢測其紋狀體氧化應激相關基因的表達。結果 與對照組相比，模型組小鼠DA水平下降，行為學成績下降，差異有統計學意義（P＜0.01）；環氧化酶-2、可誘導型一氧化氮合酶2、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶基因表達上調；而谷胱甘肽過氧化物酶3、6、8等9種基因明顯下調（改變倍數＞2）。結論 老齡PD模型小鼠氧化應激相關的基因發生上調或下調，導致氧化應激反應的發生。