MANF蛋白表達水平與肝纖維化程度的相關性研究

潘高峰，郜玉峰，葉嬌嬌，姜同翠，沈玉君，沈玉先

MANF蛋白表達水平與肝纖維化程度的相關性研究

潘高峰1，郜玉峰1，葉嬌嬌1，姜同翠2，沈玉君2，沈玉先2

目的探討中腦星形膠質細胞源性神經營養因子（MANF）蛋白在慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染患者肝纖維化發生發展中的作用及其與臨床特點的相關性。方法 采用相對和絕對定量同位素標記（ITRAQ）蛋白質組學和免疫組化法檢測肝臟穿刺組織中MANF蛋白的表達，分析其表達水平與肝臟炎癥纖維化分期的關系；采用實時熒光定量PCR技術檢測正常對照（NC）、乙肝病毒攜帶者（ASC）、慢性乙型肝炎患者（CHB）及乙肝后肝硬化患者（LC）外周血白細胞中MANF mRNA的表達水平，分析其與不同階段慢性HBV感染者的臨床病毒學和生化學指標的相關性。結果MANF蛋白主要在肝細胞質中表達，其表達水平隨著肝臟炎癥及纖維化的程度加重而升高。NC組、ASC組和CHB組分別與LC組比較，MANF mRNA的表達差異均有統計學意義（P＜0.01）。MANF mRNA（HBsAg）＜1.5×106IU／L、（1.5×106～2.0×107）IU／L和＞2.0×107IU／L 3組間差異有統計學意義（P＜0.05）；在乙肝病毒e抗原（HBeAg）陽性組與陰性組之間差異有統計學意義（P＜0.01）；在膽紅素正常組與異常組之間差異有統計學意義（P＜0.01）。結論 MANF蛋白可能參與了慢性HBV感染者肝纖維化的發生發展，并與其臨床特點相關。

MANF；內質網應激；慢性乙型肝炎；肝纖維化

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染在慢性乙型肝炎－肝纖維化－肝硬化轉化中起著重要的作用，但確切機制尚未完全闡明。大量研究［1］證實，持續的HBV復制和表達可觸發內質網（endoplasmic reticulum，ER）應激，ER應激與HBV感染后肝臟非可控性炎癥的發生發展和惡性轉化密切相關，但確切的調控機制尚未闡明。中腦星形膠質細胞源性神經營養因子（mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF）基因編碼的蛋白主要位于ER和高爾基體，是一種分泌性蛋白［2］。目前研究［3－5］表明，ER應激可以上調MANF基因的表達和蛋白的分泌，在帕金森病、腦缺血、心肌缺血等多種病理狀態下發揮細胞保護作用。ER應激上調MANF蛋白表達的作用可能在于抑制ER應激引起的過度炎癥和纖維化反應，但MANF蛋白與慢性HBV感染后炎癥和纖維化發展的相關性尚未見報道。因此，擬對不同階段的慢性HBV感染者肝臟組織和外周血MANF mRNA的表達水平進行研究，探討MANF在乙型肝炎－肝纖維化－肝硬化進程中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取2012年1月～3月在中國人民解放軍123醫院住院并行肝臟穿刺活檢的慢性HBV感染患者20例進行蛋白質組學研究，其中G1S1、G2S2、G3S3、G4S4各5例，男12例，女8例，年齡25～54（33.7±12.4）歲，分別作為G1S1組、G2S2組、G3S3組及G4S4組。選取2013年5月～2014年3月就診于安徽醫科大學第二附屬醫院肝病科的乙肝表面抗原攜帶者（asymptomatic hepatitis B virus surface antigen carriers，ASC）44例作為ASC組，慢乙肝（chronic hepatitis B，CHB）患者56例作為CHB組，乙肝后肝硬化（liver cirrhosis，LC）患者49例作為LC組，進行實時熒光定量PCR研究，同時選取40例體檢健康者（normal healthy controls，NC）作為NC組。所有病例無重疊其他肝炎病毒感染、藥物性肝病、酒精性肝病、自身免疫性肝病及其他疾病。研究方案經醫院倫理委員會審批通過，所有患者簽署知情同意書。

1.2 病理組織檢查采用1 s快速穿刺活檢術獲取長度在1.5～2.0 cm的肝臟組織，按以下步驟處理樣本：4%的甲醛固定，乙醇溶液脫水，石蠟包埋，組織切片，HE及網狀纖維染色。在光學顯微鏡下（×200）多視野觀察，病理分級參照2010年《慢性乙型肝炎防治指南》［6］。

1.3 蛋白質組學研究肝穿組織先經胰蛋白酶裂解、烷基化、酶解為肽段，得到的肽段用相對和絕對定量同位素標記（isobaric tags for relative and absolute quantitation，ITRAQ）試劑進行差異標記，再將標記樣本相混合，最后用液相－二級質譜聯用（liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，LC-MS／MS）設備進行分析，具體委托上海中科新生命生物科技有限公司完成。

1.4 免疫組化法石蠟切片常規脫蠟至水。用0.3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶。用0.1 mol／L檸檬酸鈉緩沖液進行抗原修復。4℃條件下用5%的山羊血清進行封閉，加一抗（1∶200的MANF抗體，英國Abcam公司）后4℃過夜。滴加生物素化二抗（B液）37℃孵育1 h，二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）染色。蘇木精復染，乙醇脫水，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察。

1.5 免疫組化結果判斷顯微鏡下觀察肝臟組織，肝細胞胞質內褐色顆粒為陽性結果。按染色強度及陽性細胞比例進行半定量分析［7］，二者綜合后評定結果：陰性，弱陽性，陽性，強陽性。見圖1。

1.6 實時熒光定量PCR采集HBV感染者及健康體檢者的空腹外周血1 ml，4 h內加入紅細胞裂解液，混勻后離心棄上清液留白細胞沉淀，加入TRIzol混勻后按照說明書提取RNA。1%的瓊脂糖電泳鑒定RNA。RNA的濃度及純度用分光測量儀Quawell Q5000測定。反轉錄反應按照TaKaRa PrimScript逆轉錄試劑盒說明書進行，總體系為10 μl，反應條件為37℃15 min，85℃15 s。按照GenBank數據庫提供的MANF、GAPDH基因序列，用Primer Premier 5.0軟件分別設計人源引物，委托上海生工公司合成引物，GAPDH引物：上游5′-CCACTCCTCCACCTTTG-3′，下游5′-CACCACCCTGTTGCTGT-3′；MANF引物：上游5′-TCACATTCTCACCAGCCACT-3′，下游5′-CAGGTCGATCTGCTTGTCATAC-3′。按照SYBR Green PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）說明書使用PR0961201846（美國Thermo公司）實時定量PCR儀進行反應，反應條件如下：95℃30 s預變性→（95℃5 s→60℃30 s），40個循環。1%的瓊脂糖電泳鑒定目的基因片段，GAPDH作為內參，使用2－ΔΔCT法計算基因相對表達量。

1.7 統計學處理采用SPSS 16.0軟件進行分析。定量資料進行對數轉換后采用秩和檢驗，分類資料采用Spearman秩相關檢驗進行分析。診斷分組之間的兩兩比較檢驗水準為α＝0.008 3和P＜0.008 3差異具有統計學意義，余比較檢驗水準α＝0.05和P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝穿組織蛋白質組學研究結果在對不同炎癥和纖維化分級的慢性乙型肝炎患者肝穿組織各5例進行ITRAQ蛋白組學定量研究時發現，隨著肝臟炎癥纖維化加劇，MANF蛋白的表達逐步增加，與肝臟炎癥和纖維化程度呈密切正相關。

2.2 肝穿標本中MANF蛋白表達的免疫組化結果

為了進一步證實蛋白質組學的初步發現，再次對上述標本的石蠟切片進行了MANF蛋白表達的免疫組化驗證，結果顯示G1S1組多呈陰性及弱陽性表達，G2S2組多呈弱陽性及陽性表達，G3S3及G4S4組多呈陽性及強陽性表達，與蛋白質組學的研究結果一致。

2.3 不同階段的慢性HBV感染患者外周血MANF mRNA的表達結果顯示：4組之間MANF mRNA的表達差異有統計學意義（P＝0.00）。進一步進行兩兩組間分析顯示，與LC組相比，NC組、ASC組和CHB組MANF mRNA的表達水平差異均有統計學意義（P＜0.01），其余任意兩組之間比較差異均無統計學意義。見圖2。采用秩相關檢驗示外周血白細胞中MANF mRNA表達與肝臟疾病進展存在正相關（rs＝0.376，P＝0.00）。

2.4 外周血白細胞MANF mRNA的表達水平與臨床指標的相關性將149例HBV感染者根據乙肝病毒表面抗原（hepatitis B virus surface antigen，HBsAg）水平、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）水平、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）水平、乙肝病毒e抗原（hepatitis B e-antigen，HBeAg）定性、HBV-DNA以及總膽紅素（total bilirubin，TBIL）水平分別進行分組，結果表明，MANF mRNA的表達水平在不同水平的HBsAg分組間差異有統計學意義（P＝0.043），但任意兩組間差異無統計學意義；HBeAg陽性組與陰性組外周血白細胞MANF mRNA表達差異有統計學意義（P＝0.001）；TBIL正常組與異常組之間MANF mRNA表達差異有統計學意義（P＝0.001）；但MANF mRNA表達水平在不同ALT、AST和HBV-DNA分組間差異均無統計學意義。見表1。

3 討論

MANF基因是從30 000個基因中篩選出來的并對ER應激最敏感的基因，是一種分泌性蛋白。課題組在前期研究［8］已經證實，MANF蛋白是一種ER應激相關的分泌性蛋白，ER應激上調MANF表達。而大量研究［13－14］已經證實，HBV持續感染可以導致ER應激，對MANF蛋白是否參與HBV慢性感染后肝臟炎癥和纖維化進展尚未見報道。推測，MANF很可能在肝炎到肝硬化的轉變中起著重要的作用。因此，首先選取了不同炎癥和纖維化分級的肝臟穿刺組織進行ITRAQ蛋白質組學的探索性研究，結果顯示，MANF隨炎癥和纖維化的加重而表達逐步增加，提示MANF蛋白參與了肝臟炎癥和纖維化的進展。為進一步證實蛋白質組學的初步結果，再次對進行蛋白質組學的肝臟穿刺石蠟標本進行了免疫組化研究，結果同樣證實MANF蛋白的表達隨著炎癥和纖維化程度的加重逐漸增加。目前認為，ER應激誘導的凋亡、炎癥和上皮細胞間質轉化等作為一種刺激因素參與了組織損傷和纖維化的發生發展［9］。未折疊蛋白反應（UPR）反應誘導的凋亡可以導致轉化生長因子β（TGF-β）的釋放，進一步刺激纖維化的發生發展［10］。結合前期體外研究［11］證實MANF對ER應激誘導的細胞凋亡具有保護作用。另外，通過對過表達HBx蛋白的人肝癌細胞株HepG2研究［12］表明，糖調節蛋白78（GRP78／BiP）和MANF在穩轉HBx蛋白的HepG2細胞中表達升高，這一結論從理論上支持以上觀點。MANF在多種疾病中可以保護相關細胞免受損傷，推測MANF蛋白在HBV感染后疾病進程中可能起著保護肝細胞免受損傷，其在肝硬化中的高表達很可能是機體抗纖維化的一個自我保護反應，當然也不能排除MANF本身就是一個肝纖維化的標志或促肝纖維化的指標，有待于進一步研究證實。

HBV病毒本身，HBV相關蛋白及病程中產生的炎癥及氧化應激均可觸發ER應激［13－14］。ER應激蛋白CCAAT增強子結合蛋白同源蛋白（CHOP）很可能通過上調TGF-β1、α-平滑肌肌動蛋白及膠原蛋白的表達來促進肝纖維化［15］。研究［14］證實：HBsAg在肝細胞內的聚集均會誘發ER應激，鑒于MANF蛋白是一種分泌性蛋白，因此，對不同階段的慢乙肝患者外周血MANF mRNA的表達水平進行了進一步的研究，結果表明，MANF mRNA水平隨著疾病進展表達逐漸增加，也同樣支持MANF蛋白參與了肝纖維化進展。臨床證據顯示HBsAg和HBV DNA水平越高的患者，肝纖維化程度相對較低，研究也證實MANF蛋白隨著HBsAg和HBV DNA水平的增高而表達逐步降低。本研究表明HBeAg陽性組與陰性組間MANF mRNA的表達存在差異，且陽性組MANF mRNA的表達量要高于陰性組，這可能與HBeAg陽性者肝臟受損較重，所誘導的ER應激也越激烈，從而導致MANF的高表達，而這種高表達可能是為了減輕肝細胞炎癥及纖維化。膽紅素是反映肝功能的一項重要指標，HBV感染者可因為肝細胞的損傷引起膽紅素的升高，其持續的升高往往提示肝臟損傷也在持續的加重，即可以發生嚴重的ER應激，最終導致ER應激相關基因MANF的高表達。這可以解釋TBIL異常組MANF mRNA的表達量要高于與TBIL正常組。一般而言，轉氨酶水平越高，肝細胞受損越重，但研究卻未發現外周血中MANF mRNA的表達水平與轉氨酶水平存在相關性，有待進一步擴大樣本研究。

綜上所述，本研究首次證實MANF蛋白參與了肝臟炎癥和纖維化的進展，但確切的機制尚不明確，推測MANF蛋白可能起到對抗促肝纖維化機制的作用，MANF蛋白作為一種分泌性蛋白有可能作為一個監測肝纖維化的潛在指標，進一步闡明MANF蛋白的作用機制有待進一步通過改變MANF蛋白表達量來觀察肝纖維化程度的改變程度來明確。

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Study on correlation between MANF expression levels and the grade of liver fibrosis

Pan Gaofeng，Gao Yufeng，Ye Jiaojiao，et al
（Dept of Hepatopathy，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

ObjectiveTo explore the role of mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor（MANF）protein in the development of liver fibrosis and clinical significance in the patients with chronic hepatitis B virus（HBV）infection.MethodsThe expression of MANF protein in liver biopsy tissues was detected by isobaric tags for relative and absolute quantitation（ITRAQ）and immunohistochemical method，and then the relationship of MANF expression and the degree of inflammation and fibrosis of liver were analyzed.The levels of MANF mRNA in peripheral leukocytes were measured by real-time polymerase chain reaction（PCR），and analyzed its correlation between clinical virological and biochemical data in asymptomatic hepatitis B virus surface antigen carriers（ASC），chronic hepatitis B（CHB），and liver cirrhosis（LC）.ResultsMANF protein was mainly localized in the cytoplasm of liver cells.The expression levels of MANF were gradually increased with the aggressive inflammation and fibrosis of liver.The expression levels of MANF mRNA in the patients with NC，ASC，CHB had a statistically significant difference compared to LC，respectively（P＜0.01）.The expression levels of MANF mRNA had a statistically significant difference among three hepatitis B virus surface antigen（HBsAg）levels groups（HBsAg＜1.5×106IU／L，1.5× 106IU／L～2.0×107IU／L and＞2.0×107IU／L，P＜0.05）.The difference of MANF mRNA expression levels was statistical significance between hepatitis B e-antigen（HBeAg）-positive group and HBeAg-negative group（P＜0.01），between normal and abnormal bilirubin group（P＜0.01）.ConclusionFor the patients with HBV infection，MANF protein may be involved in the development of liver fibrosis and assciated with its clinical significance.

MANF；endoplasmic reticulum stress；chronic hepatitis B；liver fibrosis

R 34

1000－1492（2015）01－0078－05

2014－09－27接收

安徽高校省級自然科學研究項目（編號：KJ2014A107）

1安徽醫科大學第二附屬醫院肝病科，合肥 2306012安徽醫科大學基礎醫學院，合肥 230032

潘高峰，男，碩士研究生；郜玉峰，男，副教授，副主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：aygyf＠126.com