探討雷帕霉素靶向抑制mTOR對大鼠心瓣膜細胞鈣化的影響及其作用機制

譚焱，王繼業(yè)，易仁亮，邱健

探討雷帕霉素靶向抑制mTOR對大鼠心瓣膜細胞鈣化的影響及其作用機制

譚焱，王繼業(yè)，易仁亮，邱健

目的：探討雷帕霉素靶向抑制mTOR對大鼠心瓣膜細胞鈣化的影響及其作用機制。

方法：體外分離大鼠心瓣膜間質(zhì)細胞后培養(yǎng)并鑒定；細胞共分為4組：正常對照組、鈣化誘導組、雷帕霉素組、鈣化誘導+雷帕霉素組；采用流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡率；采用茜素紅S染色并觀察鈣沉積的變化，對細胞進行鈣化結(jié)節(jié)計數(shù)；蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測各組細胞中骨形成蛋白-2（bmp-2），骨鈣素（osteocalcin），骨調(diào)素（osteopontin），smad同源物1（smad1）及半胱氨酸蛋白酶（caspase-3）的表達水平。

結(jié)果：成功分離獲得大鼠心瓣膜間質(zhì)細胞；各組細胞凋亡率沒有明顯差異（P＞0.05）；鈣化誘導組細胞鈣化結(jié)節(jié)數(shù)明顯高于正常對照組（P＜0.05）；鈣化誘導組細胞鈣化結(jié)節(jié)計數(shù)（0.471±0.091）較正常對照組（0.104±0.023）多，鈣化誘導+雷帕霉素組細胞鈣化結(jié)節(jié)計數(shù)（0.237±0.039）明顯少于鈣化誘導組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；鈣化誘導組細胞的骨形成蛋白-2，骨鈣素、smad同源物1和骨調(diào)素蛋白的表達水平明顯高于正常對照組（P＜0.05），鈣化誘導+雷帕霉素組的骨鈣素、smad同源物1和骨調(diào)素蛋白的表達水平明顯低于鈣化誘導組（P＜0.05），但3個實驗組間caspase-3蛋白表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

結(jié)論：mTOR抑制劑雷帕霉素通過抑制mTOR后下調(diào)其靶蛋白骨形成蛋白-2、骨鈣素、smad同源物1和骨調(diào)素蛋白的表達水平，從而抑制大鼠心瓣膜細胞的鈣化，即細胞鈣化變緩很可能與mTOR通路被抑制有密切的關(guān)系。

mTOR；雷帕霉素；心瓣膜細胞；細胞鈣化

Methods: The rat’s valvular interstitial cells were isolated and the cells were cultured in 4 groups: ①Normal control group, ②Calcification group, ③Rapamycin group and ④Calcification + rapamycin group. The apoptosis rates of valvular interstitial cells were detected by flow cytometry, calcium deposition was observed by Alizarin S staining, the calcified nodules were counted and the protein expressions of bmp-2, osteocalcin, osteopontin, smad-1 and caspase-3 were examined by Western blot analysis.

Results: The rat's valvular interstitial cells were suceessfully isolated; the cell apoptosis rates were similar among different groups, P＞0.05. The calcified nodule in Calcification group (0.471 ± 0.091) was more than Normal control group (0.104 ± 0.023), while the nodule in Calcification + rapamycin group (0.237 ± 0.039) was less than Calcification group, all P＜0.05. Compared with Normal control group, the protein expression levels of bmp-2, osteopontin and smad-1 were obviously increased in Calcification

group, P＜0.05, and compared with Calcification group, the above indexes were obviously lower in Calcification + rapamycin group, P＜0.05. The protein expression levels of caspase-3 were similar among 3 experimental groups, P＞0.05.

Conclusion: Rapamycin may down-regulate the targeting protein expressions of bmp-2, osteopontin and smad-1 via inhibiting mTOR, therefore, reducing the valvular interstitial cell calcification which might be related to mTOR pathway suppression in experimental rats.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:900.)

鈣化性主動脈瓣狹窄（Calcific aortic valve stenosis, CAVS）是一類多發(fā)的老年退行性疾病，發(fā)病率隨著年齡的增長而逐漸增高[1]。鈣化是CAVS最常見且重要的病理特征之一，近年來臨床研究發(fā)現(xiàn)，在退行性主動脈瓣病變患者的瓣膜間質(zhì)鈣化區(qū)域中，成骨細胞相關(guān)的特異基因表達增加[2]。瓣膜間質(zhì)細胞在CAVS各種發(fā)病機制中均被活化，出現(xiàn)不正常的增殖、分化，說明其在CAVS發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用，抑制其增殖、分化可能成為CAVS治療的新切入點[3]。mTOR （mammalian target of RAPA）是抗癌藥物雷帕霉素（RAPA）的靶物質(zhì)[4]，也是細胞生長的中樞控制因子，它根據(jù)細胞環(huán)境的營養(yǎng)條件做出相應的應答，參與調(diào)控蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的活性，從而控制與蛋白質(zhì)合成相關(guān)基因的表達[5]。因此在調(diào)節(jié)細胞生長與分化方面起著關(guān)鍵作用[6]。多數(shù)疾病的發(fā)生與mTOR信號通路調(diào)控異常密切相關(guān)[7]。在腫瘤方面，與之密切相關(guān)的生理過程如細胞的增殖、分化等均受mTOR的調(diào)控，抑制mTOR通路可以有效阻斷各種生長因子異常信號的轉(zhuǎn)導，抑制癌癥的發(fā)生和發(fā)展[8]。本文利用雷帕霉素靶向抑制mTOR并研究其影響大鼠心瓣膜細胞鈣化的過程及機制，為mTOR靶向抑制在心臟瓣膜、腫瘤等疾病的應用及新藥開發(fā)的靶點方面提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

材料：雷帕霉素（RAPA）購自美國sigma公司；蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測所用抗體兔抗鼠成骨相關(guān)蛋白如骨形成蛋白-2（bmp-2）、骨鈣素（osteocalcin）、骨調(diào)素（osteopontin）、smad同源物1（smad1）、半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）購自美國Abcam公司；茜素S染色試劑購自美國Sigma公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自南京凱基；鈣化培養(yǎng)基成分（含10 mmol/Lβ-甘油磷酸，50 μg/ml維生素C，100 nmol/L地塞米松的標準培養(yǎng)基）購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國GIBCO；PBS緩沖液： NaCl 8.0 g，KCl 0.2g，KH2PO40.24 g，Na2HPO4·12H2O 3.628 g，溶于800 ml蒸餾水中，用鹽酸調(diào)pH值為7.4，蒸餾水定容至1 000 ml，高壓滅菌，室溫保存?zhèn)溆茫籘ris-HCl緩沖鹽溶液（TBS）：濃度1 mol/L Tris-HCl 10 ml，加入NaCl 8.8 g，用鹽酸調(diào)pH值為7.4，蒸餾水定容至1 000 ml備用。

大鼠心瓣膜間質(zhì)細胞分離培養(yǎng)、鑒定及分組：采用膠原酶消化法體外分離大鼠心瓣膜間質(zhì)細胞并傳代培養(yǎng)于含10%胎牛血清，1% L-glutamine，100 mg/L鏈霉素，1×105U/L青霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃下，置于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞足量后，用免疫熒光化學法檢測α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、波形蛋白（vimentin）的表達，進行細胞鑒定。經(jīng)鑒定后，將細胞分為4組：正常對照組：細胞不做任何處理；鈣化誘導組：細胞接受鈣化培養(yǎng)基行鈣化誘導培養(yǎng)；雷帕霉素組：細胞接受100 nmol/L雷帕霉素培養(yǎng)；鈣化誘導+雷帕霉素組：細胞接受鈣化培養(yǎng)基與100 nmol/L雷帕霉素培養(yǎng)。

大鼠心瓣膜間質(zhì)細胞凋亡率流式檢測：細胞加藥培養(yǎng)24 h后，每組處理取3個復孔， 用0.25%胰酶消化，于1 000 r/min離心5 min后收集細胞，以PBS洗液洗2次，細胞懸于PI-Annexin v凋亡雙染試劑盒中的緩沖液中，濃度為每毫升1×106個細胞，400目篩網(wǎng)過濾，準確吸取0.5 ml細胞懸液于上樣管中，再加入5 μl Annexin v-FITC和PI染液，于室溫避光染色10 min后，上機檢測，用CellQuest軟件獲取1×104個細胞，分析活細胞、早期凋亡細胞及死亡細胞的百分率。

大鼠心瓣膜間質(zhì)細胞茜素紅S染色：細胞經(jīng)培養(yǎng)7 d后，以70%乙醇固定細胞1 h，以雙蒸水洗3次后，茜素紅S溶液染色30 min。染色后以雙蒸水洗3遍，經(jīng)鈣化誘導培養(yǎng)7 d后，經(jīng)茜素紅S染色在瓣膜間質(zhì)細胞的胞外基質(zhì)中可見鈣結(jié)節(jié)形成，經(jīng)

隨機在各實驗組各抽取5孔比較，置于顯微鏡下觀察并進行鈣化結(jié)節(jié)計數(shù)。

Western blot分析: 大鼠心瓣膜間質(zhì)細胞經(jīng)培養(yǎng)7 d后，檢測培養(yǎng)細胞中骨形成蛋白-2、骨鈣素、骨調(diào)素、smad同源物1、caspase-3蛋白的表達水平[9]。按照說明書操作進行總蛋白定量。SDSPAGE電泳后PVDF膜轉(zhuǎn)膜和孵育抗體，5 %脫脂奶粉-TBS封閉，一抗1:1 500，室溫，反應2 h。TBS洗滌PVDF膜5 min×5次，二抗1:5 000，室溫反應1 h，TBS洗5 min×5次，化學發(fā)光，顯影，定影，采用Quantity One v 4.4.0軟件對目的蛋白及GAPDH所對應條帶進行光密度分析。

2 結(jié)果

大鼠心瓣膜間質(zhì)細胞免疫熒光鑒定結(jié)果（圖1）：分離培養(yǎng)的大鼠心瓣膜間質(zhì)細胞中波形蛋白、α-平滑肌肌動蛋白均為陽性表達，證實分離培養(yǎng)的細胞為主動脈瓣膜間質(zhì)細胞。

圖1 大鼠心瓣膜間質(zhì)細胞的免疫熒光鑒定圖

大鼠心瓣膜間質(zhì)細胞凋亡測定結(jié)果：正常對照組（3.87±0.44）、雷帕霉素組（4.15±0.47）、鈣化誘導組（3.06±0.65）和鈣化誘導+雷帕霉素組（4.21±0.71）大鼠心瓣膜間質(zhì)細胞的凋亡率比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

大鼠心瓣膜間質(zhì)細胞鈣化結(jié)節(jié)定量分析（圖2）：鈣化誘導組細胞鈣化結(jié)節(jié)計數(shù)（0.471±0.091）明顯較正常對照組（0.104±0.023）多（P＜0.05），鈣化誘導+雷帕霉素組細胞鈣化結(jié)節(jié)計數(shù)（0.237±0.039）明顯少于鈣化誘導組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖2 大鼠心瓣膜間質(zhì)細胞茜素紅S染色

大鼠心瓣膜間質(zhì)細胞成骨相關(guān)蛋白表達水平的變化（圖3、表1）：鈣化誘導組細胞的骨形成蛋白-2、骨鈣素、smad同源物1和骨調(diào)素蛋白表達水平較正常對照組均升高（P＜0.05）； 鈣化誘導+雷帕霉素組的骨鈣素、smad同源物1和骨調(diào)素蛋白表達水平較鈣化誘導組均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。3個實驗組間caspase-3蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖3 大鼠心瓣膜間質(zhì)細胞成骨相關(guān)蛋白表達水平

表1 大鼠心瓣膜間質(zhì)細胞成骨相關(guān)蛋白表達水平檢測

表1 大鼠心瓣膜間質(zhì)細胞成骨相關(guān)蛋白表達水平檢測

注：與正常對照組比較*P＜0.05；與鈣化誘導組比較△P＜0.05

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3 討論

主動脈瓣瓣膜鈣化可引起主動脈瓣狹窄、關(guān)閉不全等疾病，是導致老年退行性瓣膜病的重要病理改變[10]。既往普遍認為瓣膜鈣化是被動的退行性鈣磷沉積的過程，而現(xiàn)在研究者明確該過程是一種普遍存在且高度保守的細胞通路介導的主動性過程[11]。mTOR是雷帕霉素進入細胞后的靶物質(zhì)，細胞中高度保守的FPR1基因編碼胞質(zhì)蛋白FKBPl2是雷帕霉素的直接受體[12]。mTOR抑制劑在心臟瓣膜、腫瘤等疾病方面的應用有一定的前景，其衍生的新一代的化合物有雷帕霉素、依維莫司、坦西莫司等，均具有抗生素、免疫抑制及抗腫瘤的作用[13]。目前已有的研究證實雷帕霉素具有抗動脈粥樣硬化的作用，但是，mTOR信號通路在鈣化性主動脈瓣狹窄發(fā)生、發(fā)展過程中的研究尚少有報道。以往體內(nèi)誘導動物瓣膜鈣化方法繁瑣且需時較長，穩(wěn)定性差[14]，因此建立簡易、有效、穩(wěn)定的體外瓣膜鈣化模型非常必要。

本研究采用膠原酶消化法從大鼠主動脈瓣中分離并體外培養(yǎng)瓣膜間質(zhì)細胞，以含有β-甘油磷酸的鈣化誘導培養(yǎng)基誘導鈣化，從而實現(xiàn)瓣膜細胞體外對大鼠瓣膜間質(zhì)細胞的鈣化誘導培養(yǎng)。我們早期的實驗結(jié)果顯示，在主動脈鈣化狹窄瓣膜病患者的瓣膜組織中，mTOR下游底物核糖體蛋白S6磷酸化較正常瓣膜組織中明顯升高，說明mTOR在CAVS瓣膜組織中異常活化。因此，我們推測mTOR信號通路活化參與鈣化性主動脈瓣狹窄的發(fā)生發(fā)展，其抑制劑雷帕霉素可能通過抑制瓣膜間質(zhì)細胞分化從而阻斷CAVS的發(fā)生發(fā)展。

以往的研究表明，mTOR抑制劑可能通過間接調(diào)控細胞的凋亡，影響主動脈瓣瓣膜鈣化過程[15]，但在實驗中我們發(fā)現(xiàn)，各實驗組細胞的凋亡率均沒有明顯差別（P＞0.05），說明mTOR抑制劑雷帕霉素不是通過影響細胞凋亡來抑制細胞鈣化過程。通過進一步實驗分析發(fā)現(xiàn)，mTOR抑制劑雷帕霉素抑制細胞鈣化，是通過抑制mTOR后，下調(diào)骨形成蛋白-2、骨鈣素、骨調(diào)素和smad同源物1 的表達水平而引起的，因此細胞鈣化與mTOR通路被抑制有密切的關(guān)系。瓣膜鈣化與骨組織鈣化類似，為主動可調(diào)控過程，瓣膜間質(zhì)細胞表型激活向成骨細胞轉(zhuǎn)化可能為瓣膜鈣化的病理基礎。針對瓣膜間質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)化中的關(guān)鍵作用基因，進行針對性治療，可能是未來瓣膜病治療的方向。

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Effect and Mechanism of Rapamycin Inhibiting mTOR on Heart Valve Cell Calcification in Experimental Rats

TAN Yan, WANG Ji-Ye, YI Ren-liang, QIU Jian.
Department of Cardiology, Southern Medical University, Guangzhou (510515), Guangdong, China

Objective: To investigate the effect and mechanism of rapamycin inhibiting mammalian target of RAPA (mTOR) on heart valve cell calcification in experimental rats.

Mammalian target of RAPA; Rapamycin; Heart valve cell; Cell calcification

2015-05-21）

（編輯：曹洪紅）

廣東省科技計劃項目（2012B031800418）；廣州市科技計劃項目（2013J4100117）

510515 廣東省廣州市，南方醫(yī)科大學（譚焱、邱健）、 廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院 心內(nèi)科（譚焱、 王繼業(yè)、易仁亮、邱健 ）

譚焱 主治醫(yī)師 博士研究生 主要從事冠心病的早期診治和退行性瓣膜病研究 Email:yantan1123@163.com 通訊作者： 邱健

Email: jianqiu81@163.com

R541

A

1000-3614（2015）09-0900-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2015. 09.018