急性缺氧對環匹阿尼酸誘導的大鼠遠端肺靜脈平滑肌細胞內鈣濃度升高的影響

彭公永，胡國平，趙祝香，胡錦興，鄒義敏，彭芳

急性缺氧對環匹阿尼酸誘導的大鼠遠端肺靜脈平滑肌細胞內鈣濃度升高的影響

彭公永，胡國平，趙祝香，胡錦興，鄒義敏，彭芳

急性缺氧；環匹阿尼酸；肺靜脈平滑肌細胞；細胞內Ca2+濃度；鈣池操縱性鈣通道

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:800.)

在肺循環中，肺靜脈不僅僅是毛細血管氧合后的血流入左心房的通道，而且參與調節肺泡壁毛細血管的充盈和復張，并和肺動脈一起參與調節肺通氣/灌注，肺動脈和肺靜脈的收縮均可導致肺血管阻力升高。盡管肺靜脈具有生理重要性，但肺靜脈的收縮反應較少受到關注，肺靜脈及肺靜脈平滑肌細胞（PVSMC）的缺氧性變化尚未引起重視。以往實驗表明：急性缺氧可導致包括大鼠、綿羊、雪貂、豬、狗等多種動物肺靜脈的強烈收縮[1,2]，但其具體機制尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

Ⅰ型膠原酶、氯化鈉（NaCl）、氯化鉀（KCl）、氯化鈣（CaCl2）、硫酸鎂（MgSO4）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、碳酸氫鈉（NaHCO3）、CPA、氯化鎳（NiCl2）、SKF 96365、葡萄糖、硝苯地平（美國Sigma公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）、胎牛血清、DMEM培養基（美國Gibco公司）；Fura-2 AM（美國Invitrogen公司）；顯微鑷、顯微剪（上海金鐘公司）；體式顯微鏡、熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；細胞內鈣濃度檢測系統（美國Intracellular Imaging公司）；雙通道溫度控制系統（美國Warner Instrument公司）。

1.2 大鼠遠端肺靜脈平滑肌細胞原代培養

采用筆者已經報道的方法[6-8]，6只雄性SD大鼠（體重200～250 g）腹腔注射2%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉后，開胸取心、肺，于體式顯微鏡下用顯微鑷和顯微剪分離遠端肺靜脈（4級分支以下），用Ⅰ型膠原酶消化法原代培養并鑒定大鼠遠端PVSMC。

1.3 細胞內鈣濃度測定

參照文獻[6-8]，PVSMC生長至50%～60%融合，用5 μmol/L Fura-2 AM 37℃避光負載細胞1 h，固定長有細胞的蓋玻片于熒光顯微鏡上的觀測盒內，以0.5～1 ml/min的流速用Krebs溶液（含118 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、2.5 mmol/L CaCl2、0.57 mmol/L MgSO4、1.18 mmol/L KH2PO4、25 mmol/L NaHCO3和10 mmol/L葡萄糖）灌流孵育細胞15 min，以含16%O2、5%CO2的混合氮氣持續平衡Krebs灌流液，用雙通道溫度控制系統控制觀測盒溫度37～37.2℃，打開熒光顯微鏡和細胞內鈣濃度檢測系統，實時記錄數據。

1.4 急性缺氧對環匹阿尼酸誘導的大鼠遠端肺靜脈平滑肌細胞內鈣濃度升高的影響

實驗分常氧組和缺氧組。兩組細胞先分別用16%O2、5%CO2的混合氮氣持續平衡的Krebs溶液灌流孵育5 min，然后，常氧組先用16%O2、5%CO2的混合氮氣持續平衡的含10 μmol/L CPA、5 μmol/L硝苯地平（電壓依賴鈣通道阻斷劑）無鈣Krebs液（118 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、0.57 mmol/L MgSO4、1.18 mmol/L KH2PO4、25 mmol/L NaHCO3和10 mmol/L葡萄糖）孵育10 min，再用16%O2、5%CO2的混合氮氣持續平衡的含10 μmol/L CPA、5 μmol/L硝苯地平的Krebs液孵育15 min，缺氧組先換用4%O2、5%CO2的混合氮氣持續平衡的含10 μmol/L CPA、5μmol/L硝苯地平無鈣Krebs液孵育10 min，再用4%O2、5%CO2的混合氮氣持續平衡的含10 μmol/L CPA、5 μmol/L硝苯地平Krebs液孵育15 min，最后，兩組細胞分別用16%O2、5%CO2的混合氮氣持續平衡Krebs液孵育10 min。

1.5 氯化鎳、SKF96365對急性缺氧作用的干預

NiCl2和SKF96365均為SOCC阻斷劑。實驗分對照組、NiCl2干預組和SKF96365干預組。三組細胞先分別用16%O2、5%CO2的混合氮氣持續平衡的Krebs溶液灌流孵育5 min，對照組先以4%O2、5%CO2的混合氮氣持續平衡的含10 μmol/L CPA、 5 μmol/L硝苯地平無鈣Krebs液孵育10 min，再以4%O2、5%CO2的混合氮氣持續平衡的含10 μmol/L CPA、5 μmol/L硝苯地平Krebs液孵育15 min；而NiCl2干預組和SKF96365干預組在相同時相的灌流液中分別加入500 μmol/L NiCl2和50 μmol/L SKF96365，其余處理與對照組相同，最后，各組均以16%O2、5%CO2的混合氮氣持續平衡Krebs液孵育10 min。

1.6 氯化鎳、SKF96365對高鉀引起的肺靜脈平滑肌細胞內鈣濃度升高的影響

參照文獻[9,10]，實驗分對照組、NiCl2干預組和SKF96365干預組。各組細胞先用16%O2、5%CO2的混合氮氣持續平衡的Krebs液孵育5 min，然后用16%O2、5%CO2的混合氮氣持續平衡的高鉀Krebs液（60 mmol/L KCl、60 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L CaCl2、0.57 mmol/L MgSO4、1.18 mmol/L KH2PO4、25 mmol/L NaHCO3和10 mmol/L葡萄糖）孵育10 min，NiCl2干預組和SKF96365干預組在相同時相灌流液中分別加入500 μmol/L NiCl2和50 μmol/L SKF96365，其余處理與對照組相同，最后，三組細胞分別用Krebs液孵育10 min。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 急性缺氧對環匹阿尼酸誘導的大鼠遠端肺靜脈平滑肌細胞內鈣濃度升高的影響（圖1）

圖1 急性缺氧對環匹阿尼酸誘導的大鼠遠端肺靜脈平滑肌細胞內鈣濃度升高的影響（n = 6）

2.2 氯化鎳、SKF96365對急性缺氧作用的干預（圖2）

2.3 氯化鎳、SKF96365對高鉀引起的肺靜脈平滑肌細胞內鈣濃度的影響（圖3）

圖2 氯化鎳和SKF96365對急性缺氧條件下環匹阿尼酸誘導的肺靜脈平滑肌細胞內鈣濃度升高的影響（n=6）

圖3 氯化鎳和SKF96365對高鉀引起的大鼠遠端肺靜脈平滑肌細胞內鈣濃度升高的影響（n=6）

3 討論

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Effect of Acute Hypoxia on Cyclopiazonic Acid Induced Intracellular Calcium Cation Enhancement in Rat Distal Pulmonary Venous Smooth Muscle Cells

PENG Gong-yong, HU Guo-ping, ZHAO Zhu-xiang, HU Jin-xing, ZOU Yi-min, PENG Fang.
National Key Laboratory of Respiratory Disease, Guangzhou Institute of Respiratory Diseases, The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou (510120), Guangdong, China

Acute hypoxia; Cyclopiazonic acid; Pulmonary venous smooth muscle cells; Intracellular calcium cation concentration; Store-operated Ca2+channels

2014-12-01）

（編輯：許 菁）

國家自然科學基金項目（81000020，81570045）；廣東省自然科學基金資助項目（2014A030313486）；廣州市科技計劃資助項目（201510010226）；羊城學者科研計劃學術骨干項目（10A025G）；廣州市屬高?？蒲许椖浚?0A276）；呼吸疾病國家重點實驗室青年科學基金支持項目（11）

510120 廣東省廣州市，廣州醫科大學附屬第一醫院 廣州呼吸疾病研究所呼吸疾病國家重點實驗室

彭公永 副主任醫師 博士 主要從事肺血管疾病基礎與臨床研究 Email: gongyong19761@163.com 通訊作者：彭公永

R54

A

1000-3614（2015）08-0800-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.08.020