急性缺氧對環(huán)匹阿尼酸誘導(dǎo)的大鼠遠端肺靜脈平滑肌細胞內(nèi)鈣濃度升高的影響

彭公永，胡國平，趙祝香，胡錦興，鄒義敏，彭芳

急性缺氧對環(huán)匹阿尼酸誘導(dǎo)的大鼠遠端肺靜脈平滑肌細胞內(nèi)鈣濃度升高的影響

彭公永，胡國平，趙祝香，胡錦興，鄒義敏，彭芳

急性缺氧；環(huán)匹阿尼酸；肺靜脈平滑肌細胞；細胞內(nèi)Ca2+濃度；鈣池操縱性鈣通道

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:800.)

在肺循環(huán)中，肺靜脈不僅僅是毛細血管氧合后的血流入左心房的通道，而且參與調(diào)節(jié)肺泡壁毛細血管的充盈和復(fù)張，并和肺動脈一起參與調(diào)節(jié)肺通氣/灌注，肺動脈和肺靜脈的收縮均可導(dǎo)致肺血管阻力升高。盡管肺靜脈具有生理重要性，但肺靜脈的收縮反應(yīng)較少受到關(guān)注，肺靜脈及肺靜脈平滑肌細胞（PVSMC）的缺氧性變化尚未引起重視。以往實驗表明：急性缺氧可導(dǎo)致包括大鼠、綿羊、雪貂、豬、狗等多種動物肺靜脈的強烈收縮[1,2]，但其具體機制尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

Ⅰ型膠原酶、氯化鈉（NaCl）、氯化鉀（KCl）、氯化鈣（CaCl2）、硫酸鎂（MgSO4）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、碳酸氫鈉（NaHCO3）、CPA、氯化鎳（NiCl2）、SKF 96365、葡萄糖、硝苯地平（美國Sigma公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；Fura-2 AM（美國Invitrogen公司）；顯微鑷、顯微剪（上海金鐘公司）；體式顯微鏡、熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；細胞內(nèi)鈣濃度檢測系統(tǒng)（美國Intracellular Imaging公司）；雙通道溫度控制系統(tǒng)（美國Warner Instrument公司）。

1.2 大鼠遠端肺靜脈平滑肌細胞原代培養(yǎng)

采用筆者已經(jīng)報道的方法[6-8]，6只雄性SD大鼠（體重200～250 g）腹腔注射2%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉后，開胸取心、肺，于體式顯微鏡下用顯微鑷和顯微剪分離遠端肺靜脈（4級分支以下），用Ⅰ型膠原酶消化法原代培養(yǎng)并鑒定大鼠遠端PVSMC。

1.3 細胞內(nèi)鈣濃度測定

參照文獻[6-8]，PVSMC生長至50%～60%融合，用5 μmol/L Fura-2 AM 37℃避光負載細胞1 h，固定長有細胞的蓋玻片于熒光顯微鏡上的觀測盒內(nèi)，以0.5～1 ml/min的流速用Krebs溶液（含118 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、2.5 mmol/L CaCl2、0.57 mmol/L MgSO4、1.18 mmol/L KH2PO4、25 mmol/L NaHCO3和10 mmol/L葡萄糖）灌流孵育細胞15 min，以含16%O2、5%CO2的混合氮氣持續(xù)平衡Krebs灌流液，用雙通道溫度控制系統(tǒng)控制觀測盒溫度37～37.2℃，打開熒光顯微鏡和細胞內(nèi)鈣濃度檢測系統(tǒng)，實時記錄數(shù)據(jù)。

1.4 急性缺氧對環(huán)匹阿尼酸誘導(dǎo)的大鼠遠端肺靜脈平滑肌細胞內(nèi)鈣濃度升高的影響

實驗分常氧組和缺氧組。兩組細胞先分別用16%O2、5%CO2的混合氮氣持續(xù)平衡的Krebs溶液灌流孵育5 min，然后，常氧組先用16%O2、5%CO2的混合氮氣持續(xù)平衡的含10 μmol/L CPA、5 μmol/L硝苯地平（電壓依賴鈣通道阻斷劑）無鈣Krebs液（118 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、0.57 mmol/L MgSO4、1.18 mmol/L KH2PO4、25 mmol/L NaHCO3和10 mmol/L葡萄糖）孵育10 min，再用16%O2、5%CO2的混合氮氣持續(xù)平衡的含10 μmol/L CPA、5 μmol/L硝苯地平的Krebs液孵育15 min，缺氧組先換用4%O2、5%CO2的混合氮氣持續(xù)平衡的含10 μmol/L CPA、5μmol/L硝苯地平無鈣Krebs液孵育10 min，再用4%O2、5%CO2的混合氮氣持續(xù)平衡的含10 μmol/L CPA、5 μmol/L硝苯地平Krebs液孵育15 min，最后，兩組細胞分別用16%O2、5%CO2的混合氮氣持續(xù)平衡Krebs液孵育10 min。

1.5 氯化鎳、SKF96365對急性缺氧作用的干預(yù)

NiCl2和SKF96365均為SOCC阻斷劑。實驗分對照組、NiCl2干預(yù)組和SKF96365干預(yù)組。三組細胞先分別用16%O2、5%CO2的混合氮氣持續(xù)平衡的Krebs溶液灌流孵育5 min，對照組先以4%O2、5%CO2的混合氮氣持續(xù)平衡的含10 μmol/L CPA、 5 μmol/L硝苯地平無鈣Krebs液孵育10 min，再以4%O2、5%CO2的混合氮氣持續(xù)平衡的含10 μmol/L CPA、5 μmol/L硝苯地平Krebs液孵育15 min；而NiCl2干預(yù)組和SKF96365干預(yù)組在相同時相的灌流液中分別加入500 μmol/L NiCl2和50 μmol/L SKF96365，其余處理與對照組相同，最后，各組均以16%O2、5%CO2的混合氮氣持續(xù)平衡Krebs液孵育10 min。

1.6 氯化鎳、SKF96365對高鉀引起的肺靜脈平滑肌細胞內(nèi)鈣濃度升高的影響

參照文獻[9,10]，實驗分對照組、NiCl2干預(yù)組和SKF96365干預(yù)組。各組細胞先用16%O2、5%CO2的混合氮氣持續(xù)平衡的Krebs液孵育5 min，然后用16%O2、5%CO2的混合氮氣持續(xù)平衡的高鉀Krebs液（60 mmol/L KCl、60 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L CaCl2、0.57 mmol/L MgSO4、1.18 mmol/L KH2PO4、25 mmol/L NaHCO3和10 mmol/L葡萄糖）孵育10 min，NiCl2干預(yù)組和SKF96365干預(yù)組在相同時相灌流液中分別加入500 μmol/L NiCl2和50 μmol/L SKF96365，其余處理與對照組相同，最后，三組細胞分別用Krebs液孵育10 min。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 急性缺氧對環(huán)匹阿尼酸誘導(dǎo)的大鼠遠端肺靜脈平滑肌細胞內(nèi)鈣濃度升高的影響（圖1）

圖1 急性缺氧對環(huán)匹阿尼酸誘導(dǎo)的大鼠遠端肺靜脈平滑肌細胞內(nèi)鈣濃度升高的影響（n = 6）

2.2 氯化鎳、SKF96365對急性缺氧作用的干預(yù)（圖2）

2.3 氯化鎳、SKF96365對高鉀引起的肺靜脈平滑肌細胞內(nèi)鈣濃度的影響（圖3）

圖2 氯化鎳和SKF96365對急性缺氧條件下環(huán)匹阿尼酸誘導(dǎo)的肺靜脈平滑肌細胞內(nèi)鈣濃度升高的影響（n=6）

圖3 氯化鎳和SKF96365對高鉀引起的大鼠遠端肺靜脈平滑肌細胞內(nèi)鈣濃度升高的影響（n=6）

3 討論

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Effect of Acute Hypoxia on Cyclopiazonic Acid Induced Intracellular Calcium Cation Enhancement in Rat Distal Pulmonary Venous Smooth Muscle Cells

PENG Gong-yong, HU Guo-ping, ZHAO Zhu-xiang, HU Jin-xing, ZOU Yi-min, PENG Fang.
National Key Laboratory of Respiratory Disease, Guangzhou Institute of Respiratory Diseases, The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou (510120), Guangdong, China

Acute hypoxia; Cyclopiazonic acid; Pulmonary venous smooth muscle cells; Intracellular calcium cation concentration; Store-operated Ca2+channels

2014-12-01）

（編輯：許 菁）

國家自然科學(xué)基金項目（81000020，81570045）；廣東省自然科學(xué)基金資助項目（2014A030313486）；廣州市科技計劃資助項目（201510010226）；羊城學(xué)者科研計劃學(xué)術(shù)骨干項目（10A025G）；廣州市屬高校科研項目（10A276）；呼吸疾病國家重點實驗室青年科學(xué)基金支持項目（11）

510120 廣東省廣州市，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 廣州呼吸疾病研究所呼吸疾病國家重點實驗室

彭公永 副主任醫(yī)師 博士 主要從事肺血管疾病基礎(chǔ)與臨床研究 Email: gongyong19761@163.com 通訊作者：彭公永

R54

A

1000-3614（2015）08-0800-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.08.020