響應曲面法優化厚樸酚-β-環糊精包合物的制備工藝

岳金金，張喜月，劉金穎，劉慧婷，張 玲

（遼寧醫學院畜牧獸醫學院，遼寧錦州 121001）

厚樸酚是從中藥厚樸中提取的一種含有酚羥基的生物活性物質，具有擴張血管、抗炎、抗菌、抑制血小板聚集和抗心律失常等多種作用，在醫藥等領域中有廣泛的應用。但厚樸酚性狀不穩定，在水中的溶解度和分散性差，不易加工、貯藏，使其應用受到一定的限制（沈映君，1997）。β-環糊精（β-CD）具有空腔內徑大小適中、包合力強、經濟易得等優點，與難溶性藥物容易形成穩定的水合物，制成的包合物具有性質穩定、不易揮發、有較高的水溶性和良好的分散性等特點，不僅能增加藥物分子的溶解度，還能提高藥物的穩定性和生物利用度（安偉娟等，2008）。

本試驗采用研磨法制備厚樸酚-β-環糊精包合物（厚樸酚-β-CD），運用響應曲面法優化其制備工藝條件，為工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 儀器 DZKW-4電子恒溫水浴鍋 （北京中興偉業儀器有限公司）、FA1004N電子天平 （上海精密科學儀器有限公司）、SHZ-ⅢB型循環水真空泵 （浙江臨海市精工真空設備廠）、DHG-9245A型電熱恒溫鼓風干燥箱 （上海一恒科學儀器有限公司）、紫外分光光度計（南京強拓科技有限公司）。

1.1.2 試劑 厚樸酚 （西安開來生物工程有限公司，批號：538438）；β-環糊精（中國上海惠世生化試劑有限公司，批號：120108）；甲醇、異丙醇、無水乙醇和石油醚均為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 厚樸酚包合物的制備 參照桂卉等（2005）的方法，精密稱取β-環糊精，加入4倍量的水攪拌溶解，制備出β-環糊精的飽和水溶液。將飽和水溶液倒入研缽中，并將研缽置于60℃恒溫水浴鍋中，研磨1 h后，待β-環糊精呈現糊狀后，緩慢滴加用有機溶劑溶解的厚樸酚，繼續研磨，直至再次呈現糊狀后使用真空泵抽濾，并用石油醚洗滌三次，干燥后備用。

1.2.2 厚樸酚-β-環糊精包合物中厚樸酚含量的測定

1.2.2.1 對照品溶液的制備 取60℃減壓干燥4 h的厚樸酚對照品適量，精密稱定，置100 mL量瓶中，加無水甲醇（色譜純）溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜過濾，即得對照品溶液。

1.2.2.2 標準曲線的制備 精密稱取適量厚樸酚，用無水乙醇稀釋成濃度為 3、5、7、9、11、13、15 μg/mL的系列標準溶液，于298 nm處測定吸光度，確定濃度（C）與吸光度（A）之間的線性關系。

1.2.2.3 含量測定 稱取厚樸酚-β-環糊精包合物1 mg，用50%乙醇溶解，定容至10 mL；再吸取1.0 mL置于10 mL容量瓶中用50%乙醇溶液稀釋并定容。在298 nm處測定樣品的吸光度，根據回歸方程求得厚樸酚的濃度，從而求出包合物中厚樸酚的含量。

1.2.3 單因素試驗 以β-環糊精與厚樸酚的比例（A）、研磨時間（B）、研磨溫度（C）3 個因素進行單因素試驗，按照1.2.1所述方法包合厚樸酚，并計算出被包合的厚樸酚的量。

1.2.3.1 β-環糊精與厚樸酚的比例對厚樸酚含量的影響 在研磨時間30 min、研磨溫度60℃的條件下，研究β-環糊精與厚樸酚的比例分別為3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1 時對厚樸酚含量影響。

1.2.3.2 研磨時間對厚樸酚含量的影響 在β-環糊精與厚樸酚的比例為5∶1、研磨溫度60℃的條件下，研究研磨時間分別為 10、20、30、40、50 min時對厚樸酚含量的影響。

1.2.3.3 研磨溫度對厚樸酚含量的影響 在β-環糊精與厚樸酚的比例為5∶1、研磨時間30 min的條件下，研究包合溫度分別為 45、50、55、60、65 ℃時對厚樸酚含量的影響。

1.2.3.4 響應曲面設計 在單因素試驗結果的最優水平基礎上，根據Box-Behnken設計原理，以厚樸酚含量（Y）為響應值，利用Design Expert 7.0軟件設計三因素三水平的響應曲面試驗，選取β-環糊精與厚樸酚的比例（A）、研磨時間（B）、研磨溫度（C）三個影響因素，因素及水平見表1。

表1 響應面優化試驗因素與水平

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 β-環糊精與厚樸酚的比例對厚樸酚含量的影響 由圖1可見，隨β-環糊精與厚樸酚比例的增加，包合物中厚樸酚的含量開始增高，當比例達到5∶1時厚樸酚含量最高，之后開始下降。從厚樸酚含量考慮，將二者比例控制在5∶1左右為宜。

圖1 β-環糊精與厚樸酚的比例對厚樸酚含量影響

2.1.2 研磨時間對厚樸酚含量的影響 由圖2可見，隨著研磨時間的延長，包合物中厚樸酚含量開始增大，當時間為30 min時，厚樸酚含量達到一定高度。之后隨著研磨時間的繼續延長，厚樸酚含量不再有明顯增加。結合實際情況考慮將研磨時間控制在30 min左右為宜。

圖2 研磨時間對厚樸酚含量影響

2.1.3 研磨溫度對厚樸酚含量的影響 由圖3可見，隨著研磨溫度的增加，厚樸酚含量增大，當研磨溫度達到60℃時，厚樸酚含量最高，隨后又有所下降。綜合考慮經濟因素和后續工藝的簡化，研磨溫度以60℃左右為宜。

2.2 響應曲面優化試驗 響應曲面優化試驗的取值見表2，共15個試驗點。前面12個是析因點，自變量取值在A、B、C所構成的三維頂點；后面3個為零點，為區域的中心點，用以估計試驗誤差（任濤和鐘潔，2011）。每次制得的包合物中厚樸酚含量見表2。

圖3 研磨溫度對厚樸酚含量影響

表2 厚樸酚-β-環糊精包合物制備工藝優化方案及結果

2.2.1 回歸方程 用響應曲面法對β-環糊精與厚樸酚的比例（A）、研磨時間（B）、研磨溫度（C）進行三因素三水平的分析，確定制備包合物的最佳條件，結果見表2。利用軟件對表2試驗數據進行多元回歸擬合，得到模型的二次多項回歸方程為：Y=20.50-0.34A+0.15B+0.038C-0.22AB-0.40AC-0.33BC-1.85A2-0.77B2-0.30C2。

2.2.2 回歸模型方差分析 由表3結果可知，方程一次項A、二次項A2、B2和交互項中AC對厚樸酚含量的影響均達極顯著水平（P＜0.01），二次項C2和交互BC對厚樸酚含量的影響顯著 （P＜0.05），其余項均不顯著。

2.2.3 響應曲面分析 利用Design Expert 7.0軟件對表3的數據進行二次多元回歸擬合，建立響應曲面，結果如圖4所示。

圖4a反映地是研磨溫度為60℃時，β-環糊精與厚樸酚的比例和研磨時間對厚樸酚-β-環糊精包合物中厚樸酚含量的影響。當β-環糊精與厚樸酚的比例較低時，厚樸酚含量隨著研磨時間的增加先增加后減小，當比例接近5∶1、時間接近30 min時，厚樸酚含量達到最大值。

表3 回歸模型方差分析

圖4b反映地是研磨時間為30 min，β-CD與厚樸酚的比例和研磨溫度對包合物中厚樸酚含量的影響。包合物中厚樸酚含量隨β-CD與厚樸酚的比例的增加而快速增加，當比例在5∶1附近、研磨溫度大于60℃時可以達到響應值最高點。

圖4c反映地是β-CD與厚樸酚的比例為5∶1時，研磨溫度和研磨時間對厚樸酚含量的影響。結合圖中曲線走勢可見，曲線相對較陡，兩因素的交互作用對厚樸酚含量的影響顯著（P＜0.05）。

2.2.4 確定最優條件及驗證試驗 通過軟件分析得到厚樸酚-β-CD的最優條件為：研磨溫度60.81℃、研磨時間30.96 min、β-環糊精與厚樸酚的比例為4.89∶1，此時模型預測厚樸酚含量為20.59%。考慮實際操作，將試驗條件修改為包合溫度61℃、包合時間31 min、β-環糊精與厚樸酚的比例為4.9∶1。在此修正條件下進行了3次平行驗證試驗，厚樸酚-β-CD包合率的平均值為20.27%，RSD為0.47%，與理論預測值（20.59%）相比誤差為0.32%。

3 討論與結論

由回歸模型方差分析結果可知：模型P＜0.01，說明本次試驗的響應回歸模型具有極顯著水平；模型的校正系數R2＞0.99，說明該模型與實際試驗擬合性非常好；R2Adj的數值表示該模型能解釋97.36%響應值的變化，試驗誤差小，可以很好地描述β-CD與厚樸酚的比例、研磨時間、研磨溫度與厚樸酚-β-CD包合率的真實關系。方程一次項、二次項和交互項的P值表明各個因素與響應值之間不是簡單的線性關系，而具有一定的交互作用，采用響應曲面法進行的優化試驗所得回歸方程模型可以用來分析預測厚樸酚-β-CD的包合結果。得出最佳工藝條件為：研磨溫度61℃、研磨時間31 min、β-環糊精與厚樸酚比例為 4.9∶1。通過在最佳條件下的驗證試驗表明，厚樸酚-β-CD包合物中厚樸酚含量為20.27%。可見運用響應曲面法優化厚樸酚-β-CD的制備工藝可以獲得最大的厚樸酚含量，參數準確可靠，具有實用價值。

[1]安偉娟，鎖然，李娜，等.白藜蘆醇-羥丙基-β-環糊精包合物的制備及鑒定[J].河北農業大學學報，2008，32（1）：104.

[2]桂卉，劉東文，顏紅，等.白術、木香混合揮發油β-CD包合物的制備與鑒定[J].中成藥，2009，31（6）：864.

[3]任濤，鐘潔.響應曲面法優化超聲波輔助提取蒲公英糖蛋白工藝[J].食品工業科技，2011，32（7）：297～302.

[4]沈映君.中藥藥理學[M].上海：上海科學技術出版社，1997.83.