激素協(xié)同作用對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞激素受體基因表達(dá)的影響

田 青 ， 王洪榮

（1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇淮安 223003；2.揚(yáng)州大學(xué)，江蘇揚(yáng)州 225009）

激素受體是激素發(fā)揮其功能的主要途徑。Lee等（2011）發(fā)現(xiàn)胰島素（INS）要發(fā)揮其功能，必須先與α亞單位結(jié)合后，β亞單位中酪氨酸激酶才被激活，進(jìn)而使受體磷酸化，介導(dǎo)和調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)酶系統(tǒng)活性，控制物質(zhì)代謝。李真和李慶章（2010）發(fā)現(xiàn)在奶牛乳腺組織中，胰島素及其受體的變化是有規(guī)律的，INS濃度從妊娠期開(kāi)始上升至分娩前達(dá)到最大，而后開(kāi)始下降；胰島素受體（INSR）的表達(dá)量從青春期到泌乳初期逐漸升高，到泌乳高峰期持續(xù)高水平，隨后開(kāi)始下降；催乳素也必須先與特定組織（如脾臟、淋巴結(jié)、胸腺、乳腺、卵巢等）催乳素（RPLR）基因結(jié)合才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其功能（王亮，2013）。研究表明，在奶牛乳腺內(nèi)，催乳素首先與其受體結(jié)合，然后激活JAK2激酶，并通過(guò)JAK-STAT信號(hào)通路刺激乳腺腺泡發(fā)育，并在乳腺組織中刺激乳腺酪蛋白基因的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)乳的生成與分泌、發(fā)動(dòng)和維持泌乳（Akers，2006）。在體內(nèi)，糖皮質(zhì)激素與其胞內(nèi)核受體結(jié)合后才能啟動(dòng)并調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)和乳蛋白的合成，并且通過(guò)基因組機(jī)制實(shí)現(xiàn)其生理藥理功能（李敏，2010）。

大量研究表明，激素與激素之間或激素與生長(zhǎng)因子之間均存在一定的協(xié)同作用，如催乳素（PRL）能增加胰島素促進(jìn)乳汁分泌和改善乳品質(zhì)的作用效果，同時(shí)添加蛋白質(zhì)前體物氨基酸尤其是必需氨基酸能顯著提高泌乳奶牛的產(chǎn)奶性能等。也有研究表明，INS、PRL和氫化可的松(HYD)對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)、相關(guān)基因表達(dá)及酪蛋白相對(duì)含量的影響均存在著最佳使用劑量，即PRL 50 ng/mL、INS 50 ng/mL 和 HYD 1 ng/mL，且三者協(xié)同作用能促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖，抑制其凋亡，從而為乳腺的泌乳奠定良好的生理基礎(chǔ)（田青和王洪榮，2014、2013）。由此可以推測(cè)，三種激素的協(xié)同作用對(duì)其受體有一定的影響作用。因此，本試驗(yàn)以本試驗(yàn)室前期凍存的奶牛乳腺上皮細(xì)胞為對(duì)象，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究了INS、PRL和HYD的協(xié)同作用對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞激素受體基因表達(dá)的影響，旨在得到有利于促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞三種激素受體基因表達(dá)的最佳濃度組合，為后期的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 細(xì)胞：揚(yáng)州大學(xué)草食動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室凍存的4代奶牛乳腺上皮細(xì)胞。

主要試劑：DMEM/F12 （Gibco）、 胎牛血清（FBS，Gibco）、催乳素（Sigma）、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒（Gibco）、表皮生長(zhǎng)因子（Sigma）、氫化可的松（Sigma）、胰島素（Sigma）、胰蛋白酶（Gibco）、DMSO（Gibco）、兩性霉素 B（Amresco）、PBS（北京索萊寶）、熒光定量檢測(cè)試劑盒（TaKaRa，寶生物）。

儀器與設(shè)備：電熱恒溫CO2培養(yǎng)箱 （美國(guó)Thermo）、倒置顯微鏡（CKX41，Olympus）、冷凍離心機(jī) （5415R 型， 德國(guó) Eppendorf）、PCR 儀（ABI 2720型）、NanoDrop ND-1000濃度測(cè)定儀 （美國(guó)Thermo）、 熒光定量 PCR 儀 （ABI 7500 型）、i-MarkTM 酶標(biāo)儀（168-1130，美國(guó) Bio-Rad）、移液器（德國(guó) Eppendorf）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 細(xì)胞復(fù)蘇后等密度接種于6孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)70%～80%時(shí)，先用無(wú)血清、無(wú)激素但含雙抗、兩性霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基過(guò)渡16 h以上，后采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，即分別用含有不同濃度激素組合的生長(zhǎng)培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，具體方案見(jiàn)表1。

1.3 RNA的提取、cDNA的合成與real-time PCR 總RNA的提取：生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后收獲細(xì)胞， 用 RNAiso Plus （TaKaRa，D9108A）總RNA提取試劑盒提取RNA，所有RNA樣品用紫外分光光度計(jì) （NANODROP-1000）測(cè)定其 260/280 nm吸收比率值，用以檢測(cè)RNA濃度、純度和完整性。提取的RNA保存于-70℃，待用。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平 ng/mL

反轉(zhuǎn)錄：以提取的RNA為模板，用Prime-Script? RT Master Mix（TaKaRa，DRR036A）反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA，其總反應(yīng)體系為80 μL。轉(zhuǎn)錄得到的RT-PCR反應(yīng)液于4℃保存。

real-time PCR：反轉(zhuǎn)錄得到的RT反應(yīng)液用SYBR? Premix Ex TaqTM II（TaKaRa，DRR081A）試劑盒進(jìn)行real-time PCR，采用20 μL體系。反應(yīng)條件為 95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40 個(gè)循環(huán)；溶解曲線(xiàn) 95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s。

各基因的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCT值表示。

1.4 奶牛乳腺上皮細(xì)胞中激素受體相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè) 以GAPDH為內(nèi)參，采用Primer3軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物信息見(jiàn)表2。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 所有原始數(shù)據(jù)先用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，用SAS 9.1中ANOVA進(jìn)行顯著性分析，Tukey法進(jìn)行多重比較，P＜0.05表示差異顯著，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

表3結(jié)果顯示，各試驗(yàn)組三種激素受體基因表達(dá)量與對(duì)照組相比差異均不顯著（P>0.05），各試驗(yàn)組之間三種激素受體基因表達(dá)量差異也不顯著（P>0.05），但各試驗(yàn)組三種激素受體基因表達(dá)量均高于對(duì)照。

表2 引物信息

表3 激素協(xié)同作用對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞激素受體基因表達(dá)的影響

從三種激素協(xié)同作用對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞影響的最優(yōu)組合和影響程度來(lái)看，對(duì)s-PRLR基因，三種激素的最優(yōu)組合為A1B2C2（PRL 5 ng/mL、INS 50 ng/mL、HYD 1 ng/mL），三種激素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響程度為C＞B＞A；對(duì)NR3C1基因，三種激素的最優(yōu)組合為 A2B1C3（PRL 50 ng/mL、INS 5 ng/mL、HYD 10 ng/mL），三種激素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響程度為A＞B＞C；對(duì)INSR基因而言，三種激素的最優(yōu)組合為 A2B2C1（PRL 50 ng/mL、INS 50 ng/mL、HYD 0.1 ng/mL），三種激素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響程度為A＞C＞B。

3 討論

通過(guò)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析可以看出，受體基因不同，三種激素的最優(yōu)組合和影響程度也各不相同，試驗(yàn)結(jié)果并未表現(xiàn)出明顯的規(guī)律，也沒(méi)有對(duì)三種激素受體均一致的最優(yōu)組合。但可發(fā)現(xiàn)，三種激素的組合中某種激素含量高，對(duì)應(yīng)的該種激素受體的表達(dá)量就高 （氫化可的松除外，NR3C1的表達(dá)量隨著氫化可的松的增加而降低），由此可知，對(duì)于泌乳期的奶牛，催乳素的需要量適當(dāng)大一些，胰島素次之，氫化可的松的用量最小。

研究認(rèn)為胰島素通過(guò)與受體結(jié)合，主要通過(guò)mTOR信號(hào)通路發(fā)揮作用，即胰島素激活I(lǐng)RS-1，IRS-1的磷酸化可活化信號(hào)分子PI3K，活化后的PI3K催化其下游靶蛋白Akt磷酸化，磷酸化的Akt抑制TSC2的活性，在TSC1的參與下，mTOR被激活，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)節(jié)糖代謝的功能 （Biona和Loor，2011；Sophie 等，2007）；對(duì)于催乳素，比較公認(rèn)的則是催乳素與受體結(jié)合后激活JAK2/STAT5信號(hào)通路，也可激活Ras/Raf/MAPK及ERK和PI3K/AKT信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖，維持泌乳和促進(jìn)乳蛋白的合成（Swaminathan 等，2008；Wagner等，2004；）；關(guān)于氫化可的松參與奶牛乳蛋白合成調(diào)控的研究并不多見(jiàn)，但有研究表明糖皮質(zhì)激素通過(guò)調(diào)控E6-P53-miR145信號(hào)通路誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥表型 （杜利彬，2011），也有研究表明氫化可的松發(fā)揮作用主要是在機(jī)體處于能量負(fù)平衡等特殊狀態(tài)下促進(jìn)乳腺周?chē)鸂I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重分配而維持產(chǎn)奶量和乳蛋白含量的，由此可以推測(cè)，動(dòng)物處于不同生理?xiàng)l件下，氫化可的松的作用信號(hào)通路不同，糖皮質(zhì)激素發(fā)揮的作用也不同。在奶牛的乳腺中，前期研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)添加氫化可的松的確具有增加奶牛乳腺上皮細(xì)胞合成乳蛋白能力的作用（田青和王洪榮，2014）。

從功能上來(lái)看，催乳素的主要功能是啟動(dòng)和維持泌乳，胰島素則主要與能量代謝有關(guān)，而氫化可的松主要與炎癥反應(yīng)（免疫）有關(guān)。催乳素可以通過(guò)與其受體結(jié)合先為泌乳的啟動(dòng)和維持奠定生理基礎(chǔ)（充分發(fā)育的乳腺），胰島素可以通過(guò)與其受體結(jié)合為乳腺上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、泌乳的啟動(dòng)和維持提供能量保證（充分的能量），而氫化可的松則可以通過(guò)與其受體結(jié)合而維持乳腺細(xì)胞組織健康。在體外培養(yǎng)的條件下，奶牛乳腺上皮細(xì)胞要增殖和生長(zhǎng)就需要較多的催乳素和胰島素參與，所以催乳素和胰島素受體的表達(dá)量也相對(duì)較高；而體外培養(yǎng)主要是在無(wú)菌條件下培養(yǎng)得到的具有正常形態(tài)和生物學(xué)功能的健康乳腺上皮細(xì)胞，所以不需要更多的氫化可的松發(fā)揮其抗炎癥功能，因此對(duì)應(yīng)的氫化可的松受體基因表達(dá)量就較低。

4 結(jié)論

4.1 催乳素、胰島素和氫化可的松協(xié)同作用有利于促進(jìn)PRLR、NR3C1、INSR基因受體的表達(dá)。

4.2 催乳素、胰島素和氫化可的松協(xié)同促進(jìn)s-PRLR、NR3C1和INSR基因表達(dá)的最優(yōu)組合分別為催乳素5 ng/mL、胰島素50 ng/mL、氫化可的松1 ng/mL，催乳素50 ng/mL、胰島素5 ng/mL、氫化可的松10 ng/mL和催乳素50 ng/mL、胰島素50 ng/mL、氫化可的松0.1 ng/mL；對(duì)s-PRLR、NR3C1和INSR基因表達(dá)影響的大小次序分別為：氫化可的松>胰島素>催乳素；催乳素>胰島素>氫化可的松；催乳素>氫化可的松>胰島素。

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