小型豬下頜骨放射性骨壞死動物模型的建立

李松 房殿吉 王占義 翟璐璐 寧兆榮 郭延偉

1.長春市口腔醫院口腔頜面外科，長春 130000；2.上海市閔行區牙病防治所口腔頜面外科，上海 200011；3.吉林大學植物科學學院，長春 130062；4.佳木斯大學附屬第二醫院口腔醫院口腔頜面外科，佳木斯 154000

下頜骨放射性骨壞死（osteoradionecrosis，ORN）是頭頸部惡性腫瘤放射治療后所發生的嚴重并發癥，該病最早由Regaud于1922年提出，近年有報道其發病率可高達37%[1-2]。迄今為止，關于下頜骨ORN的病因病理尚不十分清楚，臨床上進行治療也存在很大困難。隨著放射治療技術的發展，以往的一些動物實驗在動物選擇及照射技術等方面顯示出不足之處。本研究首次應用現代三維適形放療（three dimensional conformal radiotherapy，3D-CRT）技術，采用電子直線加速器為照射源，建立了小型豬下頜骨ORN動物模型，為進一步研究下頜骨ORN的基礎和臨床問題奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和分組

本研究選用北京農業科學院實驗動物研究所提供的實驗用小型豬24只，體重25～30 kg，年齡12～15個月。單籠飼養，每日早晚喂食標準混合飼料2次，自由飲水，適應性飼養2周后，進行實驗。根據照射劑量的不同，隨機分為25 Gy組和28 Gy組，每組12只。

1.2 照射源和照射方法

1.2.1 照射源 照射源用電子直線加速器（美國瓦里安公司），射線平均能量6 mV，劑量率320跳·min-1。

1.2.2 照射方法 借助模擬定位（CT-SIMULATION，CT-SIM）輔以計算機治療計劃系統，利用Pinnacle3軟件（ADAC公司，美國）制定3D-CRT計劃。采取一次性照射方法，2組動物的照射劑量分別為25 Gy和28 Gy。根據線性—二次模式總效應方程換算，單次照射25 Gy相當于分割照射劑量和為65 Gy的總效應；單次照射28 Gy相當于分割照射劑量和為80 Gy的總效應。照射前按0.1 mL·kg-1劑量，小型豬耳后肌肉內注射噻胺酮（氯胺酮和麻保靜）麻醉。小型豬的照射體位為俯臥位，射線以右側下頜骨為中心，呈37°和217°對穿照射，加30°楔形板校正劑量。照射野為右側下頜骨，上界為下頜骨上緣，下界為下頜骨下緣，前界為下頜第一磨牙前緣，后界為下頜升支前后緣間的中線。

1.3 拔牙

照射結束后2個月隨機選取2組動物各9只，拔除雙側下頜第一磨牙。

1.4 觀察指標

1.4.1 肉眼觀察 包括局部皮膚顏色和毛發狀況，有無頜面部皮膚及黏膜壞死潰爛、瘺道形成、張口受限。

1.4.2 X線及CT檢查 照射結束后定期攝片觀察骨質密度和骨質破壞吸收情況。X線片拍攝應用自制頭顱固定裝置，取下頜骨斜側位，避免雙側下頜骨影像疊加。

1.4.3 病理檢查 對頜面部死骨暴露的動物，麻醉后鉗取小塊暴露之死骨；其余動物分別于照射結束后6～8個月處死，切取壞死骨組織。標本浸入中性甲醛液中固定，常規脫鈣、包埋、切片、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后于光鏡下觀察。

2 結果

2.1 肉眼觀察

照射結束后，25 Gy組和28 Gy組動物右下頜均出現不同程度的壞死。照射結束后3～4周首先出現放射野內黏膜的脫色，與照射野外的黏膜之間界限清晰，隨后出現黏膜上皮的充血水腫和上皮脫落，伴有或不伴有潰瘍，上述癥狀于照射結束后7周達高峰狀態，之后逐漸減輕。照射結束后2個月，25 Gy組動物照射野內皮膚發生脫屑及色素加深；28 Gy組動物照射野內皮膚出現大皰，隨后皰頂上皮脫落而形成潰瘍，潰瘍愈合后表面遺留色素斑和瘢痕。照射結束后6個月始，各組動物照射區域內皮膚均發生不同程度的萎縮，牙齒拔除的動物出現皮下組織僵硬、固定。各組動物的左下頜（非放射側）第一磨牙拔牙創均于拔牙后1個月左右愈合；右下頜（放射側）第一磨牙拔牙創形成慢性不愈創口，25 Gy+拔牙組動物黏膜壞死潰爛，右側頜面部瘺管形成，長期流膿，惡臭明顯（圖1）；28 Gy+拔牙組中有3例動物于拔牙后1個月形成右側頜面部洞穿性缺損，張口受限嚴重，咬合錯亂（圖2）。

圖1 照射結束后3個月，25 Gy+拔牙動物右側頜下照射區域內出現瘺道，內有壞死組織（箭頭示）Fig 1 Three months after irradiation, group of 25 Gy+tooth extraction, mandible irradiated area appeared fistula on the right side of the jaw, necrotic tissue inside (arrow)

圖2 照射結束后3個月，28 Gy+拔牙動物照射區域內形成洞穿性缺損，創口不愈（箭頭示）Fig 2 Three months after irradiation, group of 28 Gy+tooth extraction, mandible irradiated area formatted perforated defect,wound was not healing (arrow)

2.2 X線及CT改變

右下頜第一磨牙拔除后1個月，各組動物右側下頜骨斜側位片可見照射區域內骨質密度不均，骨小梁模糊或消失，呈不規則斑點狀破壞，邊緣模糊；右下頜第一磨牙拔除后3個月，照射區域骨質密度更低，同時在陰影區背景內夾雜著團塊或點狀密度增高的病理性骨沉積，骨質破壞區形態不規則，范圍擴大（圖3）；隨后的觀察中可見大小不等、形態不一的死骨，1例28 Gy+拔牙動物于拔牙后3個月出現病理性骨折（圖3）。截止照射結束后8個月，未拔牙動物雙側下頜骨骨小梁及骨密度未見異常改變。各組動物左下頜第一磨牙拔牙創正常愈合，3個月后X線片顯示骨質密度接近正常（圖3）。右下頜第一磨牙拔除后2個月，螺旋CT表面遮蓋（shaded surface display，SSD）三維重建顯示下頜骨照射區域內不規則骨質破壞區，骨密質不連續；冠狀CT薄層掃描骨窗顯示骨質密度減低，骨密質破壞，骨松質變形增厚，骨髓腔與外界相通（圖4、5）。在上述的改變中，28 Gy+拔牙動物組動物癥狀出現的早而重。

圖3 下頜骨X線片觀察結果Fig 3 X-ray observation of mandible

圖4 螺旋CT三維重建結果Fig 4 Reconstructed results of three-dimensional spiral CT

2.3 病理切片觀察

放射結束后3個月，25 Gy+拔牙動物右側下頜骨照射區域內光鏡檢查見板層骨紋理粗糙，部分骨細胞消失，骨陷窩空虛，成骨和破骨現象均不明顯；28 Gy+拔牙動物切片顯示板層骨結構模糊或斷裂，骨細胞大部分消失，鏡下表現為缺少細胞結構的紊亂的一團組織。牙齒拔除動物左側下頜骨及未拔牙動物的雙側下頜骨光鏡檢查未見明顯改變（圖6）。

圖5 冠狀CT薄層掃描結果Fig 5 Coronary CT thin layer scanning results

圖6 下頜骨組織病理觀察結果 HE × 100Fig 6 Observations of mandibular histopathology HE × 100

3 討論

3.1 放射技術和放射線的種類

放射治療作為治療腫瘤的外照射治療方式已有上百年的歷史，國內外一些學者[3-5]采用傳統的放射治療技術建立了不同動物的下頜骨ORN動物模型。由于受技術限制，傳統放射治療不能將放射劑量都集中于靶區，靶區空間定位和界定描述精度差，導致實驗結果的劑量值不精確[6]。本研究首次采用了目前臨床應用的3D-CRT技術，建立了小型豬下頜骨ORN動物模型，更好地模擬了當今放射治療的臨床實際情況。與以往通過傳統放射治療技術建立的模型相比，本研究中的下頜骨靶區是被3D-CRT一層層（slice by slice）界定的，從而使射線的高劑量區在立體空間上與靶區的實際形狀一致，實驗結果的劑量值更精確。

放射線的種類也直接影響對下頜骨的損害程度，以往的下頜骨ORN動物模型均是采用深部X線或60Co作為照射源的。深部X線主要用于表淺病灶的放射治療，其低能量部分毫無治療價值，對骨的損傷大；60Co衰變過程中放出的γ射線的穿透力大于深部X線，但能量固定且半衰期短。直線加速器的劑量率高，能量可調控，近年已逐步在臨床放射治療中占主導地位。本研究所有動物均采用電子直線加速器作為照射源，建立的動物模型更具有基礎研究價值和實際臨床意義。

3.2 下頜骨ORN模型動物

動物實驗是醫學研究的重要手段，1958年Chambers等[3]率先采用狗進行動物實驗，觀察牙齒與ORN的關系。此后少數的國外學者采用鼠、兔、猴等動物進行過相關的基礎研究。國內學者[4-5]先后通過制作狗的頜骨ORN動物模型開展研究工作。從動物選擇角度分析，鼠、兔等動物體型小，對放射耐受力差，口內操作困難，下頜骨骨量小且頜弓狹窄，不易通過X線及CT檢查觀察頜骨損害，也不便進行同一個體雙側下頜骨的對照研究；猴、猩猩等靈長類動物不便飼養，價格昂貴，來源困難，限制了應用；狗是常用的實驗動物，耐受力強，但研究表明狗不患齲齒等某些人類口腔疾病，與人類差異較大，仍不能作為較理想的下頜骨ORN實驗動物。

小型豬在生理和免疫等方面與人類相近，在醫學研究領域的應用日益廣泛。同時，小型豬的頜面部解剖、牙齒的萌出和替換也與人類有很大的相似性，并患人類的某些口腔疾病，因此是研究下頜骨ORN較為理想的實驗動物。本研究選用的小型豬是由北京農業科學院實驗動物研究所進行多代選種，封閉飼養繁殖，經遺傳學、微生物學及多項生理生化指標的檢測證明其具有獨立遺傳特性，從而保證了實驗結果的科學性和可靠性。

3.3 下頜骨ORN動物模型的可信性

下頜骨ORN是頭頸部惡性腫瘤放射治療后所發生的嚴重并發癥，下列因素被認為與其發生緊密相關：1）放射劑量超過65 Gy；2）放射周期短；3）下頜骨位于照射區域內；4）拔牙、外科手術或其他類型的外傷刺激存在[7-9]。本研究分別采用25 Gy和28 Gy單一劑量照射，根據線性—二次模式總效應方程換算，其劑量分別相當于多次分割照射的65 Gy和80 Gy，均≥65 Gy的臨界性指標。單次照射減少了實驗動物麻醉意外和全麻次數對實驗結果的影響，而且與多次分割照射相比，單次照射使正常組織的耐受力降低，縮短發生并發癥的潛伏期，便于在有限的時間內觀察到下頜骨ORN發生、發展的全過程。本研究的放射區域位于下頜骨體后部，下頜骨的血管解剖特點使下頜骨的血運供應要較上頜骨和其他頜骨差，而下頜骨體后部的骨質致密且內有未萌出的恒牙，同其他頜骨相比該區域更易遭受射線的損傷。照射結束后2個月，隨機選取2組動物各9只拔除雙側下頜第一磨牙，左下頜第一磨牙拔牙創1個月余愈合，而右下頜第一磨牙拔牙創不愈，黏膜壞死潰爛，造成持續的刺激。

下頜骨ORN的診斷主要依靠臨床癥狀和局部體征，X線及CT檢查仍為臨床上廣泛應用的重要診斷指標。本研究中，右下頜第一磨牙拔除后1個月，25 Gy+拔牙組動物口內拔牙創周圍黏膜潰爛，放射區域內皮膚形成口內外瘺管，隨后創口不愈，長期流膿，下頜骨逐漸暴露；X線片顯示典型下頜骨ORN表現，早期放射區域內骨質密度降低，骨質破壞區形態不規則，逐漸頜骨骨質呈彌散性片狀破壞，可見大小不一死骨；25 Gy+拔牙組動物拔除右下頜第一磨牙后2個月行CT和冠狀CT薄層掃描骨窗檢查顯示出不規則骨質破壞區，骨密質不連續；病理切片檢查從組織病理學角度也驗證了下頜骨ORN的發生，主要表現為骨的變性與壞死。

2組動物左下頜第一磨牙創口均于拔除后1個月左右愈合，骨質密度也于3個月左右接近正常，排除了實驗中發生化膿性頜骨骨髓炎的可能性；臨床上，下頜骨ORN需要同放療期間的腫瘤復發與腫瘤壞死相鑒別，本研究均采用的是正常實驗用小型豬，故不涉及此問題。

本研究中，25 Gy和28 Gy組拔牙動物都先后出現下頜骨ORN局部體征，并通過上述手段加以驗證了下頜骨ORN的發生，只是隨劑量的加大，28 Gy+拔牙組動物癥狀出現早而重。因此，本研究認為25 Gy+拔牙能建立有效、可信的小型豬下頜骨ORN動物模型，為進一步研究其病因及治療奠定了基礎。

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