糖基化終末產物對人牙周膜干細胞骨向分化過程中的Wnt經典信號通路研究

伍燕 鄧超 楊琨 崔曉霞 劉琪 金巖

1.遵義醫學院附屬口腔醫院，遵義 563003；2.貴陽市口腔醫院牙周科，貴陽 550002；3.第四軍醫大學組織工程中心，西安 710032

糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGEs）與糖尿病多種并發癥的發生密切相關[1]。近年來，有研究[2]表明糖尿病患者晚期AGEs的大量積聚可促進糖尿病的發展，并且可誘導牙周病的發生和發展。人牙周膜干細胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）具有自我更新和多向分化潛能，在維持牙周結構穩態方面起著重要的作用，其功能數量的變化會導致牙周膜的破壞[3]。研究[4]表明AGEs能使hPDLSCs增殖過程中的Wnt經典通路受到抑制，最終導致該細胞增殖能力有所減弱，AGEs又可以抑制該細胞的成骨分化能力，并在一定范圍內呈濃度依賴性[5]。但AGEs是否影響了hPDLSCs骨向分化過程中的Wnt經典信號通路，目前尚無定論，故本實驗旨在研究AGEs介導下的hPDLSCs骨向分化過程中的Wnt經典通路，并與正常細胞進行比較，從而探討糖尿病牙周炎的發病機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

α-MEM培養基、胰蛋白酶（Gibco公司，美國），膠原酶、胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），AGEs-BSA（Bio Vision公司，美國），細胞總RNA提取試劑盒、一步法逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）試劑盒（Takara公司，日本），茜素紅（上海化學試劑采購供應站），β-鏈蛋白（β-catenin）兔抗人單克隆抗體（Abcam公司，美國），體式顯微鏡、倒置相差顯微鏡以及照相系統（Olympus公司，日本），流式細胞儀（Beckmen Coulter公司，美國），實時聚合酶鏈反應（real time polymerase chain reaction，real time PCR）儀器（Applied biosystems公司，美國）。

1.2 取材和細胞培養

收集12～18歲因正畸需要而拔除的牙周健康、無齲壞的年輕前磨牙，PBS沖洗后刮取根中1/3牙周膜組織，移入無菌培養皿內，加入少許α-MEN培養液，將牙周膜組織銳性分離，離心后棄上清，加入膠原酶至37 ℃、CO2孵箱中消化15 min，加入正常培養液終止其消化作用，離心后取上清，將分離的組織塊均勻平鋪于6孔板中，以無菌蓋玻片覆蓋組織塊，加入含10%胎牛血清的α-MEM培養液，置37 ℃、5%CO2孵箱中培養，待組織塊周圍有細胞爬出時去除蓋玻片，每3 d換液，待細胞生長達80%時進行傳代。

1.3 有限稀釋法克隆化培養純化hPDLSCs

參照以往文獻報道采用有限稀釋法對hPDLSCs進行克隆分離。首先獲取第一代牙周膜細胞，將第一代牙周膜細胞懸液有限稀釋至密度為每毫升10個，用加樣器向96孔培養板每孔內加0.15 mL，使每孔細胞懸液中約1個細胞，經過37 ℃、5%CO2培養箱中培養，細胞貼壁后在倒置顯微鏡下檢查，挑選含單細胞孔，做標記并補加0.1 mL培養基，待孔中細胞增至占孔底面積l/3～l/2時，常規培養傳代。

1.4 hPDLSCs初步鑒定

取克隆純化的hPDLSCs，棄培養液，PBS洗2次，胰蛋白酶消化3 min，α-MEM培養基終止，800 r·min-1離心5 min，棄上清；再以含3%胎牛血清的PBS重懸細胞，使細胞密度達到每升3.0×109個，分裝到Eppendof管中，每管200 μL的細胞懸液，室溫下每個管加入2 μL的STRO-1、CD14、CD105、CD29小鼠抗人單克隆抗體，避光4 ℃冰箱孵育1 h；再用含3%胎牛血清的PBS清洗3次，1 000 r·min-1離心5 min，最后再以含3%胎牛血清的PBS重懸。使用同型對照單克隆抗體確定背景標記，用流式細胞儀分析熒光細胞，專用的配套軟件計算細胞表面抗原陽性表達率，單位用百分比表示。

1.5 分組成骨誘導后堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和茜素紅染色

實驗分為正常hPDLSCs組（N-hPDLSCs組）和AGEs刺激的正常hPDLSCs組（A-hPDLSCs組）。N-hPDLSCs組用含10%血清的正常α-MEM培養基培養；A-hPDLSCs組加入含10 μg·mL-1AGEs，10%血清的α-MEM培養基培養。分別取第3代克隆形成細胞以每毫升5×104個的密度接種于6孔板中，待細胞增殖到70%時，按以上分組加成骨誘導液（10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉、10-8mol·L-1地塞米松、50 μg·mL-1維生素C）分別誘導7 d和21 d，每3 d換液一次；對照組細胞不加誘導液，常規培養，7 d后行ALP染色，21 d后行茜素紅染色。

1.6 real time PCR檢測

分別取第3代克隆形成細胞以每毫升5×104個的密度接種于小瓶中，待細胞增殖到70%時，分4組：N-hPDLSCs組（用含10%血清的正常α-MEM培養基培養）；Os N-hPDLSCs組（用含有成骨誘導液的10%血清的α-MEM培養基培養）；A-hPDLSCs組（用含10 μg·mL-1AGEs，10%血清的α-MEM培養基培養）；Os A-hPDLSCs組（用含10 μg·mL-1AGEs，且含成骨誘導液的10%血清的α-MEM培養基培養）。每3 d換液一次，7 d后分別提取RNA，RT-PCR檢測成骨相關基因骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）、ALP、runt相關轉錄因子2（runt related transcription factor 2，Runx-2）及Dickkopf-1蛋白（DKK-1）、β-catenin表達。用細胞總RNA提取試劑盒一步法提取培養細胞總RNA，β-actin為內參照。參照GenBank數據庫，采用Primer primer 5.0計算機軟件設計引物，由Takara公司（日本）合成，反應條件參考產品說明書，引物序列如下。β-actin上游引物序列：5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'，下游引物序列：5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'；Runx-2上游引物序列：5'-CACTGGCGCTGCAACAAGA-3'，下游引物序列：5'-CATTCCGGAGCTCAGCAGAATAA-3'；ALP上游引物序列：5'-GGACCATTCCCACGTCTTCAC-3'，下游引物序列：5'-CCTTGTAGCCAGGCCCATTG-3'；BSP上游引物序列：5'-CTGGCACAGGGTATACAGGGTTAG-3'，下游引物序列：5'-ACTGGTGCCGTTTATGCCTTG-3'；β-catenin上游引物序列：5'-AGGAAGCTTCCAGACACGC-3'，下游引物序列：5'-CGCACTGCCATTTTAGCTCC-3'；DKK-1上游引物序列：5'-CACTGCATTTGGATAGCTGGTT-3'，下游引物序列：5'-GAAGGTCTGTCTTGCCGGATAC-3'。

1.7 Western blot檢測

采用Western blot檢測各組總蛋白中成骨蛋白BSP、Runx-2的表達及核蛋白中β-catenin的表達，采用細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒進行核蛋白提取，蛋白含量測定采用Bradeford蛋白濃度測定試劑盒。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）電泳，轉膜，封閉，免疫反應，最后進行化學發光反應，對2組間相關蛋白表達進行分析。

1.8 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，兩獨立樣本均數比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 hPDLSCs的分離與培養

本實驗采用酶解組織塊法培養原代細胞，一般3～10 d組織塊周圍有細胞爬出（圖1），再通過有限稀釋法得到正常的hPDLSCs，該細胞形態呈長梭形，胞核聚集在中心，胞體豐滿，2周左右可達80%匯合。

圖1 原代細胞（左）和第一代牙周膜細胞（右）的形態觀察倒置顯微鏡 × 20Fig 1 Morphology of primary cells (left) and the first generation of periodontal ligament cells (right) inverted microscope × 20

2.2 流式細胞儀對干細胞初步鑒定

采用流式細胞儀對表型分子進行鑒定，表面抗原STRO-1、CD14、CD105、CD29陽性率分別為10.4%、0.6%、96.0%、98.4%。

2.3 分組成骨誘導后ALP和茜素紅染色比較

誘導7 d后，進行ALP染色，A-hPDLSCs組明顯淺于N-hPDLSCs組（圖2）。誘導21 d后，比較2組成骨誘導形成的鈣化結節：發現在相同視野下，A-hPDLSCs組形成的鈣化結節明顯少于N-hPDLSCs組（圖3）。

圖2 ALP染色結果Fig 2 ALP staining

圖3 成骨誘導21 d后，鈣化結節形成 茜素紅染色 × 10Fig 3 After 21 days, the formation of calcified nodules alizarin red staining × 10

定量分析得到，A-hPDLSCs組和N-hPDLSCs組OD值分別為0.145 75±0.036 29、0.538 50±0.033 04，二者間差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 RT-PCR檢測成骨相關基因及Wnt經典通路相關基因表達

通過RT-PCR檢測誘導7 d后的成骨基因，發現A-hPDLSCs組ALP、BSP、Runx-2基因表達均低于N-hPDLSCs組（P＜0.05），差異有統計學意義（圖4）。誘導7 d后Wnt經典通路相關基因：N-hPDLSCs組DKK-1明顯上調，β-catenin表達下調，而A-hPDLSCs組DKK-1表達低于N-hPDLSCs組，β-catenin表達高于N-PDLSCs組（P＜0.05），差異具有統計學意義（圖4）。

圖4 成骨誘導前后N-hPDLSCs組和A-hPDLSCs組ALP、BSP、Runx-2、DKK-1、β-catenin基因的比較Fig 4 The expression levels of ALP, BSP, Runx-2, β-catenin and DKK-1 between N-hPDLSCs and A-hPDLSCs before and after the osteogenic induction

2.5 Western blot比較成骨相關蛋白以及細胞核中βcatenin蛋白表達

成骨誘導前后N-hPDLSCs組和A-hPDLSCs組BSP、Runx-2和β-catenin的表達見圖5。

圖5 成骨誘導前后N-hPDLSCs組和A-hPDLSCs組BSP、Runx-2和β-catenin的表達Fig 5 Expression of BSP, Runx-2, β-catenin between N-hPDLSCs and A-hPDLSCs before and after the osteogenic induction

圖5結果顯示，A-hPDLSCs組骨相關蛋白表達都弱于N-hPDLSCs組，N-hPDLSCs組在成骨誘導后細胞核中的β-catenin表達明顯地減弱，成骨誘導后A-hPDLSCs組β-catenin的表達明顯高于N-hPDLSCs組。

3 討論

hPDLSCs是具有自我更新和多向分化潛能，在維持牙周結構穩態方面起著重要的作用，牙周組織再生中最直接、最可靠、最不可缺少的干細胞，具備向其他類型組織細胞分化的潛能，當牙周組織受到損傷后，牙槽骨缺失，hPDLSCs會遷移并且分化為成骨細胞修復牙槽骨的缺損[6]。研究[7-9]顯示，在體外成骨誘導培養的條件下，hPDLSCs能分化為成骨樣細胞，形成鈣化結節，表達一些成骨相關蛋白：骨鈣素、骨橋素、膠原等。

對于糖尿病患者，其AGEs是不斷積累的，在前期的研究結果中表明AGEs能夠在一定濃度上抑制hPDLSCs的成骨分化，并且100 μg·mL-1AGEs刺激該細胞能使該細胞增殖過程中的Wnt經典信號通路受到抑制，為了研究骨分化過程中的信號通路不受到細胞增殖方面的干擾，本實驗選擇10 μg·mL-1AGEs濃度刺激該細胞，首先確認10 μg·mL-1AGEs對該細胞成骨能力的影響，實驗結果顯示體外成骨誘導1周后的ALP染色，A-hPDLSCs組的染色明顯淺于N-hPDLSCs組，并且在誘導3周后，對細胞進行礦化結節染色，鏡下觀察可見，礦化結節在同一個視野下，N-hPDLSCs組礦化結節形成較多且很明顯，而A-hPDLSCs組形成的結節偏少。最后進行定量分析，得到的結果也是A-hPDLSCs組形成的礦化結節少于N-hPDLSCs組細胞；其次，本實驗在成骨誘導7 d后檢測成骨基因ALP、Runx-2、BSP結果顯示，2組細胞在加了成骨誘導液后，成骨基因表達都有所上升，但A-hPDLSCs組成骨基因表達上調不明顯，與N-hPDLSCs組相比較明顯偏低，差異有統計學意義。這種趨勢與成骨能力表象的比較相一致。故在10 μg·mL-1AGEs刺激下，hPDLSCs成骨的能力下調。

各信號通路之間的相互作用決定著干細胞的命運和組織再生，其中的Wnt經典信號通路研究較成熟，該通路由分泌型的Wnt蛋白與卷軸受體結合而起始，最終導致β-catenin在胞漿中穩定積累并大量進入細胞核內激活淋巴增強因子（lymphoidenchancer factor，LEF）/ T細胞因子（T-cell factor，TCF）轉錄因子，激活了該通路，啟動靶基因轉錄[10]。故本實驗主要檢查該通路里細胞核中的β-catenin以確定該信號通路的狀態。

Wnt信號通路在不同類型、不同分化階段中的干細胞作用是不相同的，該信號通路中相關因子的相互作用調控著該條通路的開啟和關閉，最終以達到調節干細胞中相關的基因，從而調控細胞的形態及決定其分化的能力。有研究發現Wnt經典信號通路的激活可以促進成骨：LRP5（是Wnt經典通路通路中主要相關因子）的功能喪失性突變，造成Wnt經典信號通路的抑制，最終導致骨質密度降低，而功能獲得性突變使得Wnt經典信號通路激活則會導致骨質密度增高癥[11]；sFRP1基因缺陷的小鼠表現為Wnt信號通路的激活和骨量增多，在其骨骼中，TCF1、Runx-2和骨鈣素表達明顯增多[12]。相反也有研究[13]表明Wnt經典通路的激活也可以抑制成骨：通過在含有Wnt3a無血清條件培養基中培養或表達Wnt1的慢病毒載體轉染，激活了通路，最終人骨髓間充質細胞（human mesenchymal stem cells，hMSCs）的骨向分化受到抑制、細胞增殖能力增強；Derfoul等[14]通過基因轉染使鼠胚胎間充質系C3HIOTl/2表達Wnt3a，結果發現Wnt3a能顯著抑制其他成骨的標志基因如BSP、骨橋蛋白基因的表達。本實驗主要檢測該通路中的主要抑制因子DKK-1基因表達和βcatenin（其中包括β-catenin基因表達及單獨提取細胞核中的β-catenin蛋白的表達），通過比較該2個因子在正常hPDLSCs成骨誘導前后的變化以及誘導后N-hPDLSCs組與A-hPDLSCs組的區別，來探討AGEs刺激下，hPDLSCs骨分化過程中的Wnt經典通路是否受到影響。本實驗研究結果顯示對于正常hPDLSCs而言，成骨誘導后DKK-1基因表達明顯上調，βcatenin基因表達下調，并且核蛋白里的β-catenin蛋白表達下調，可以確定Wnt通路處于抑制狀態，故可以推斷正常牙周膜干細胞在向成骨分化的過程中Wnt經典通路是受到了一定程度的抑制。通過對誘導后的正常組與AGEs刺激組比較，由于AGEs的刺激，抑制因子DKK-1基因表達降低，β-catenin基因表達明顯升高，并且細胞核中的β-catenin蛋白表達升高，得到AGEs激活了的Wnt經典通路，這與正常的hPDLSCs骨分化過程中Wnt經典通路的抑制狀態相反。

綜上所述，AGEs能改變正常hPDLSCs骨分化過程中的Wnt經典通路，使該通路處于激活狀態；AGEs抑制了hPDLSCs成骨分化。而AGEs是否通過激活Wnt經典通路影響hPDLSCs的骨分化能力，還需要大量的實驗研究。

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