CCL3、CCL4下調(diào)表達和重癥繼發(fā)性肺結(jié)核病理損傷的關(guān)系

蘇瑾文，劉艷華，楊秉芬，程小星(解放軍309醫(yī)院結(jié)核病研究所ICU，北京 0009;解放軍309醫(yī)院結(jié)核病研究室;通訊作者，E-mail:xc36cn@63.com)

重癥肺結(jié)核［1］是指各型血型播散性肺結(jié)核及3個肺野以上的繼發(fā)性肺結(jié)核。其中重癥繼發(fā)性肺結(jié)核病灶范圍大，病理損害嚴(yán)重，肺結(jié)構(gòu)的破壞使得呼吸功能受到嚴(yán)重影響，死亡率增加［2］。已有研究證實肺結(jié)核組織損傷是由遲發(fā)型超敏反應(yīng)引發(fā)、Th2輔助T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)［3］所致，但其免疫病理機制仍不十分明確，本研究前期用基因表達譜芯片［4］篩選重癥繼發(fā)性肺結(jié)核患者的差異基因，以期發(fā)現(xiàn)并研究重癥繼發(fā)性肺結(jié)核患者差異基因與肺結(jié)構(gòu)嚴(yán)重損害的關(guān)系。芯片結(jié)果顯示有大量表達下調(diào)基因，其中趨化因子CCL3、CCL4表現(xiàn)為表達下調(diào)，本研究進一步從多角度驗證了CCL3、CCL4的表達下調(diào)，并對其表達下調(diào)與重癥病例病變的關(guān)系做了初步探索。

1 資料與方法

1.1 入選標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)重癥肺結(jié)核的定義，結(jié)合自己的研究目的確定入選標(biāo)準(zhǔn)。重癥:病灶范圍在三個肺野以上，病灶斑片狀并伴有壞死、空洞、實變等病變。輕癥:結(jié)核病灶范圍在兩個肺野以下，病灶點狀或索條狀，且無空洞形成者。對照:正常健康人。排除標(biāo)準(zhǔn):①使用過激素者;②有合并癥者;③合并結(jié)核性胸膜炎和肺外結(jié)核者;④病變范圍兩個肺野以下有空洞者及三個肺野以上無空洞、壞死、實變者。肺結(jié)核的診斷按照中華醫(yī)學(xué)會《臨床診療指南》(結(jié)核病分冊)［5］。本研究得到解放軍309醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 臨床標(biāo)本的采集

解放軍309醫(yī)院結(jié)核病研究所2012-04～2013-10確診為繼發(fā)性肺結(jié)核的患者90例，男性48例，女性42例，均無基礎(chǔ)疾病;同期健康對照33例，來自解放軍309醫(yī)院體檢中心健康查體者，男性17例，女性16例。其中5例重癥、5例輕癥、5例健康送檢芯片。其余病例用于做RT-PCR和ELISA檢測，每組20例。采集靜脈抗凝血2 ml，于室溫下放置，在采集后6 h內(nèi)處理。

1.3 外周血單個核細胞的分離

Ficoll淋巴細胞分離液(美國GE公司)分離抗凝血。方法 :吸取2 ml平衡至室溫的Ficoll到離心管中，再緩慢加入2 ml混勻的抗凝血，1 000×g離心20 min，吸取中間的白膜層，分別用10 ml 1640完全培養(yǎng)基(美國Gibco公司)、350×g 7 min和1 ml 1640完全培養(yǎng)基、300×g 5 min洗滌，棄去上清，沉淀即為外周血單個核細胞。

1.4 細胞總RNA的提取

Trizol法提取細胞總RNA。方法 :按1×106細胞/ml Trizol的比例加入Trizol(美國invitrogen公司)，渦旋使其完全裂解，室溫靜置5 min;按0.2 ml氯仿/1 ml Trizol加入氯仿，渦旋30秒后室溫靜置5 min，4℃ 12 000×g離心15 min;取上層無色水相至新離心管中，按0.5 ml異丙醇/1 ml Trizol比例加入異丙醇，混勻后室溫放置10 min，沉淀 RNA，4℃12 000×g離心10 min，棄上清;加入1 ml 75%的乙醇洗滌沉淀，4℃ 7 500×g離心5 min，棄上清，室溫干燥10 min;加入100 μl DEPC水，-20℃保存。

1.5 cDNA 合成

采用TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent kit［RR037A，寶生物工程(大連)有限公司］的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按說明書操作，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系為:5 ×buffer 2 μl;Enzyme 0.5 μl;Oligo dT 0.5 μl;Random6 0.5 μl;Total RNA 5 μl;加 ddH2O 補充到10 μl。反應(yīng)條件為:37 ℃，15 min;85 ℃，5 s。

1.6 實時熒光定量PCR(RT-PCR)

采用 KAPA SYBR FAST qPCR kit(KM4105，KapaBiosystems)熒光定量試劑盒測定外周血單個核細胞CCL3和CCL4 mRNA的表達，重癥、輕癥組各20例，健康對照8例。內(nèi)參基因:GAPDH。引物和內(nèi)參基因由上海生工生物公司合成。以cDNA為模板擴增基因，擴增反應(yīng)體系為:SuperReal Premix(SYBR Green)10 μl;Forward Primer 0.4 μl;Reverse primer 0.4 μl;cDNA(template)2 μl;RNase ddH2O 7.2 μl，總量為 20 μl。設(shè)定反應(yīng)條件:第一步 95 ℃3 min;第二步95℃ 3 s，60℃ 20 s，進行40個循環(huán)。

用2-Δct計算每個候選基因的相對表達量。當(dāng)目標(biāo)基因和參照基因有相同的擴增效率時，ΔCt目標(biāo)基因=Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因。

1.7 ELISA法驗證CCL3和CCL4

對CCL3、CCL4進一步用ELISA方法驗證細胞蛋白表達量。重癥、輕癥組和健康對照各20例用EDTA或肝素抗凝的外周血標(biāo)本2-4 ml，3 000 r/min、10 min離心吸取血漿。先用標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋后做標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后在微孔板內(nèi)每孔加樣100 μl，37℃孵育2 h，再經(jīng)洗板及先后加一抗、二抗、底物及終止反應(yīng)等步驟，最后用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光值。

1.8 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)分析

Graphad prism5統(tǒng)計軟件分析組間差異。用方差分析方法判斷數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，組間比較用非參數(shù)檢驗判斷重癥、輕癥繼發(fā)性肺結(jié)核患者與對照組之間表達量的統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病例臨床資料

對45例重癥和45例輕癥患者的臨床資料總結(jié)見表1。

從表1的臨床資料中可看出，重癥患者痰抗酸染色陽性、復(fù)治、耐藥比例均高于輕癥組，有吸煙、飲酒史的患者比例高于輕癥組，病程在3年以上的比例高于輕癥組，營養(yǎng)狀況相對差，即白蛋白和血紅蛋白低于輕癥組。

表1 45例重癥與45例輕癥肺結(jié)核患者的臨床數(shù)據(jù) (n=45)Table 1 Com parison of clinical data between 45 cases of severe TB and 45 cases of mild TB (n=45)

2.2 細胞總RNA質(zhì)控

本實驗以送檢芯片標(biāo)本為代表檢測RNA純度為A260nm/A280nm≥1.80;經(jīng)甲醛變性膠電泳檢測RNA完整性，9號RNA樣品電泳條帶清晰，28S∶18S rRNA條帶亮度大于或接近1∶1，其余樣品電泳條帶清晰，28S∶18S rRNA條帶亮度大于或接近2∶1;RNA總量≥1 μg，質(zhì)量符合芯片實驗要求(見圖1)。

圖1 細胞總RNA電泳圖Figure 1 Electrophoresis of cellular total RNA

2.3 表達譜芯片檢測結(jié)果

分組比較篩選出差異基因數(shù)目為:重癥vs輕癥406條，重癥vs健康668條，輕癥vs健康12條;其中下調(diào)基因數(shù)目在重癥vs輕癥264條，重癥vs健康351條，輕癥vs健康12條。從中可見差異表達基因以下調(diào)為主，有較多免疫相關(guān)基因表現(xiàn)為下調(diào)，其中CCL3 下調(diào)84.69%，CCL4 下調(diào)87.73%。

2.4 RT-PCR 驗證 CCL3、CCL4表達

CCL3、CCL4的熔解曲線為單一峰，證實 PCR擴增特異性較好。從標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的擴增效率為90%，因此相對表達量計算為1.90-Δct。對重癥、輕癥和健康對照組CCL3、CCL4的相對定量Ct值經(jīng)計算后進行統(tǒng)計。由于數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布數(shù)據(jù)，組間兩兩比較用非參數(shù)檢驗方法。統(tǒng)計結(jié)果顯示，RTPCR驗證重癥與輕癥、健康對照組比較CCL3、CCL4表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，見表2)，RT-PCR驗證結(jié)果與芯片相符。

表2 重癥、輕癥組和健康對照組RT-PCR檢測值的比較Table 2 Com parison of RT-PCR results between severe secondary TB，mild secondary TB patients and healthy controls

2.5 ELISA 驗證 CCL3、CCL4的表達

對ELISA方法檢測重癥、輕癥和健康對照組CCL3、CCL4的吸光值進行統(tǒng)計，因數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布數(shù)據(jù)，組間兩兩比較用非參數(shù)檢驗方法。重癥與輕癥組比較、重癥與健康組比較CCL3表達下調(diào)(P＜0.05);重癥與輕癥組比較、重癥與健康對照組比較CCL4表達下調(diào)(P＜0.05)。結(jié)果 顯示重癥患者CCL3、CCL4血漿蛋白表達水平下調(diào)，與芯片結(jié)果相符(見表3)。

表3 重癥、輕癥組和健康對照組ELISA檢測吸光值的比較Table 3 Com parison of ELISA results between severe secondary TB，mild secondary TB patients and healthy controls

3 討論

繼發(fā)性肺結(jié)核臨床特征有別于原發(fā)結(jié)核和原發(fā)后結(jié)核，以肺內(nèi)實質(zhì)性病變?yōu)橹鳎洳±磉^程可以有浸潤、滲出、干酪、增殖、纖維化、鈣化等，肺結(jié)構(gòu)損害輕重程度差異很大，輕者病灶局限，而重者有空洞、干酪壞死、實變、毀損肺等病變使肺結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，成為肺部感染、呼吸功能障礙的基礎(chǔ)。不同的預(yù)后被認為是結(jié)核菌和機體特異性免疫反應(yīng)間復(fù)雜相互作用的結(jié)果。對病情與病變差異的原因和機制尚不十分明確，病變的加重與很多因素有關(guān)，如吸煙、酗酒、各種合并癥(糖尿病、肝炎、器官移植、腎功能衰竭等)、治療依從性、社會經(jīng)濟因素等，但可能最終影響的仍是免疫功能。病例的臨床資料也提示重癥與輕癥相比吸煙、飲酒發(fā)生率高、病程長、痰菌陽性率高，營養(yǎng)狀況差等可能都是導(dǎo)致病變加重的因素。還有研究證實與遺傳素質(zhì)有關(guān)［6］，因此我們用基因表達譜芯片來篩選無基礎(chǔ)疾病和合并癥的重癥繼發(fā)性肺結(jié)核患者與輕癥、健康人相比的差異基因，以期發(fā)現(xiàn)重癥患者肺部病變嚴(yán)重與其他人群有不同的基因表達。結(jié)果 顯示，重癥組有大量差異基因，其中CCL3、CCL4等免疫相關(guān)基因表現(xiàn)為表達下調(diào)，差異基因表達的改變及其對信號通路的影響可能是導(dǎo)致重癥繼發(fā)性肺結(jié)核病變嚴(yán)重的分子基礎(chǔ)。由于芯片實驗也存在一定系統(tǒng)誤差，對于篩選出的差異表達基因仍需進一步用分子生物學(xué)手段驗證。本研究分別用實時熒光定量PCR和ELISA方法驗證了CCL3、CCL4在重癥、輕癥患者及健康對照組的表達情況，驗證結(jié)果與芯片相符，因此驗證差異基因的方法和結(jié)果是可靠的。

CCL3和CCL4屬于趨化因子CC配體［chemokine(C-C motif)ligand，CCL］家族，分別稱為巨噬細胞炎癥蛋白MIP-1α和MIP-1β。感染結(jié)核菌后可通過宿主細胞表面分子和結(jié)核菌細胞膜、細胞壁相互作用誘導(dǎo)巨噬細胞產(chǎn)生趨化因子［7］。研究發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核患者的肺泡巨噬細胞、單核細胞THP-1細胞系、支氣管肺泡灌洗液和胸腔積液中都有CCL3、CCL4等因子產(chǎn)生［8］。感染牛型結(jié)核分支桿菌的樹突細胞CCL3、CCL4等趨化因子增高表達，并可誘導(dǎo)NK細胞亞群NKp46(+)CD2(-)向樹突細胞遷移［9］。因此，我們認為 CCL3、CCL4的產(chǎn)生是抗結(jié)核免疫反應(yīng)的體現(xiàn)，機體感染結(jié)核菌后應(yīng)有一個升高的過程，從而參與早期固有免疫機制。印度人群的研究顯示，CC趨化因子的基因多態(tài)性和肺結(jié)核易感性或抗結(jié)核能力相關(guān)，其中涉及CCL3、CCL4的基因多態(tài)性［10］，可見，CCL3和CCL4在抗結(jié)核免疫中有重要的防御作用。但我們的驗證實驗顯示輕癥患者表達CCL3、CCL4與健康人相比無統(tǒng)計學(xué)意義，并沒有明顯升高表達現(xiàn)象，可能與研究的標(biāo)本和方法不同有關(guān)。

研究證實CCL3和CCL4均參與了結(jié)核肉芽腫的形成［11］。而肉芽腫的形成被認為是抗結(jié)核細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)良好的表現(xiàn)，如果參與免疫的細胞反應(yīng)失控將導(dǎo)致大量壞死和組織結(jié)構(gòu)破壞，空洞形成［12］。參與肉芽腫形成的細胞如肺泡巨噬細胞、多核巨細胞和樹突細胞等均可被結(jié)核菌誘導(dǎo)產(chǎn)生CCL3、CCL4?；罨?T細胞能被調(diào)節(jié)表達分泌CCL5、CCL3、CCL4等趨化因子，在募集淋巴細胞、Th1表達和肉芽腫形成中發(fā)揮了必不可少的作用［13］。因此，CCL3、CCL4通過趨化多種細胞在結(jié)核菌感染部位形成肉芽腫來發(fā)揮抗結(jié)核作用。本研究CCL3、CCL4在重癥肺結(jié)核患者表達下調(diào)，提示其參與肉芽腫形成進而局限結(jié)核菌引起的炎癥反應(yīng)功能下降，使抗結(jié)核的免疫保護受到抑制，可能與病變加重、病灶擴大有關(guān)。重癥患者CCL3、CCL4表達下調(diào)的原因機制尚不清楚。我們推測感染結(jié)核菌后CCL3、CCL4及其他趨化因子是升高表達的，但由于多種原因病情未得到控制和好轉(zhuǎn)，使得病情加重后患者的免疫功能受到抑制，其表達反而下調(diào)。由于結(jié)核病是一種慢性消耗性疾病，病變持續(xù)存在和擴大導(dǎo)致機體過度消耗和營養(yǎng)不良等情況發(fā)生，直接影響了免疫功能。

綜上所述，本研究通過芯片篩選重癥繼發(fā)性肺結(jié)核的差異表達基因，發(fā)現(xiàn)部分免疫相關(guān)基因下調(diào)，CCL3和CCL4通過RT-PCR和ELISA驗證，結(jié)果顯示與芯片相符。CCL3和CCL4能吸引炎性細胞并通過參與肉芽腫形成來發(fā)揮抗結(jié)核作用，但其表達下調(diào)可能使感染結(jié)核菌的炎癥反應(yīng)和病灶不能局限而成為促使病變加重的因素之一，其表達下調(diào)在免疫病理中的機制不清楚，尚待進一步研究。

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