益生菌Lactobacillus casei Zhang和Bifidobacterium lactis V9在活性乳酸菌飲料中的應用*

陳世賢，高鵬飛，王記成，孫 婷，張興昌，司徒文佑，張和平

1(內蒙古伊利實業集團股份有限公司，伊利創新中心，內蒙古呼和浩特，010110)

2(內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，內蒙古呼和浩特，010018)

益生菌是指一類非致病的經過消化系統對人體健康產生積極作用的微生物［1］，它們通過改善人體內的微生態平衡進而促進人體健康。2001年，FAO/WHO(世界糧農組織/世界衛生組織)定義益生菌為“一類活的微生物，足量攝入后對宿主健康有益”［2］。因此，足夠的活菌數量和良好的存活穩定性是益生菌用于產品開發及發揮其益生功能的前提。

L.casei Zhang分離自傳統發酵酸馬奶(koumiss)，具有良好的耐酸性、人工胃腸液耐受性及膽鹽耐受性［3］。研究證明，L.casei Zhang可在小鼠腸道內定殖并對病原性大腸桿菌具有拮抗作用［4］，具有顯著的抗氧化、降血脂、調節免疫、抑制腫瘤等功效［5-8］。其益生特性通過基因組學和蛋白質組學研究得到了進一步的驗證［9-10］。

B.lactis V9分離自健康蒙古族兒童糞便中，具有穩定的遺傳性［11］。B.lactis V9對人工胃腸液具有良好的耐受性［12］，對致病菌株(志賀氏痢疾桿菌、沙門氏菌、綠膿桿菌、埃希氏大腸桿菌)具有一定程度的拮抗作用，可以有效治療小鼠的腹瀉［13］。臨床研究表明，B.lactis V9具有調節腸道菌群的作用，對便秘和急慢性腹瀉患者治療效果顯著［14］。

近幾年，干酪乳桿菌因其特殊的生理功效及風味，被廣泛應用于活性乳酸菌飲料中，且目前市場上常見的活性乳酸菌飲料幾乎都是利用干酪乳桿菌單株菌發酵而成。本研究將L.casei Zhang與B.lactis V9復配添加到滅菌牛乳中發酵制備活性乳酸菌飲料，評價2株益生菌對活性乳酸菌飲料風味的影響及貨架期內的存活穩定性，為L.casei Zhang與B.lactis V9在產品中的應用提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

益生菌 LactobacilluscaseiZhang(L.casei Zhang)、Bifidobacterium lactis V9(B.animalis V9)，由內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室友情提供。

1.2 發酵乳基料的制備

脫脂奶粉(12%)、葡萄糖(3%)(45℃水合30 min)→殺菌(95℃，5 min) →冷卻至 3 7℃ →接種益生菌 →37℃恒溫發酵 2 0 h →后熟12 h備用

不同樣品中，L.casei Zhang與B.animalis V9的添加量見表1。

1.3 活性乳酸菌飲料樣品的制備

白砂糖(12%)+穩定劑(CMC 0.3%、三聚磷酸鈉0.03% ) →50℃ 溫 水溶解 →殺菌(95℃，5 min) →冷卻至 2 0℃ →加入發酵乳基料 →調整pH值至4.0→20 MPa 均質 →成品

表1 樣品中L.casei Zhang和B.animalis V9的添加量Table 1 The addition of L.casei Zhang and B.lactis V9 in different samples

1.4 pH值測定

將活性乳酸菌飲料樣品調整溫度至20℃，采用精密pH計(雷磁PHS-3C，海精密科學儀器有限公司)測量。

1.5 活菌數測定

L.casei Zhang的選擇性培養:將10.0 g活性乳酸菌飲料樣品加入90.0 g蛋白胨水溶液(8.5 g/L NaCl，1.0 g/L 蛋白胨)中，于水平搖床(200 r/min)振搖30 min，然后于上述蛋白胨水溶液梯度稀釋，采用MRS-V(萬古霉素50 mg/L)固體培養基平板傾注法，37℃厭氧培養48 h。

B.animalis V9的選擇性培養:10.0 g活性乳酸菌飲料樣品于90.0 g PBS水溶液(8.0 g/L NaCl，0.20 g/L KH2PO4，1.15 g/L Na2HPO4，0.50 g/L 半胱氨酸)中，于水平搖床(200 r/min)振搖30 min，然后于上述PBS水溶液梯度稀釋，采用莫匹羅星鋰鹽(Li-Mupirocin添加量為0.05 g/L)改良MRS瓊脂培養基平板傾注法，37℃厭氧培養72 h。

1.6 活性乳酸菌飲料樣品感官評定

活性乳酸菌飲料的感官評定標準見表2。

表2 活性乳酸菌飲料的感官評定標準Table 2 Sensory evaluation criteria of active lactobacillus beverage

2 試驗結果與分析

2.1 不同發酵乳基料樣品終點pH值比較

不同發酵乳基料在37℃下恒溫發酵20 h后終點pH值如表3所示。

表3 不同發酵乳基料樣品37℃恒溫發酵20 h終點pH值比較Table 3 pH comparison of different sample fermented at 37℃for 21 h

由表3中結果可知，在37℃下恒溫發酵20 h，益生菌添加活菌數量越高，發酵乳基料樣品的終點pH值越低，其中，總添加量為2.0×107CFU/g時，pH值可達到4.00;總添加活菌數相同的前提下，B.animalis V9的添加會略延緩發酵乳基料樣品酸度的降低速率，但無顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 貯藏期內不同活性乳酸菌飲料樣品pH值的變化

貯藏期內不同活性乳酸菌飲料樣品pH值變化見表4。

表4 不同活性乳酸菌飲料樣品在4℃28 d貯藏期內pH值的變化Table 4 pH changes of differentactive lactobacillus beverage samples during the storage at 4℃for 28 d

由表4可以看出，4℃下貯藏28 d，不同樣品的pH值均保持在4.00±0.05范圍內不變，即6種活性乳酸菌飲料樣品的酸度在貨架期內均可以保持穩定的水平。

2.3 貯藏期內不同活性乳酸菌飲料樣品中益生菌活菌數的變化

將活性乳酸菌飲料樣品在4℃下貯藏28 d，不同樣品中L.casei Zhang和B.animalis V9活菌數的變化見圖1。

圖1 不同活性乳酸菌飲料樣品在4℃28 d貯藏期內益生菌活菌數的變化Fig.1 Changes of probiotics viable counts in different active lactobacillus beverage samples during the storage at 4℃for 28 d

由圖1(a)可知，利用L.casei Zhang單獨發酵制備活性乳酸菌飲料的最適添加量為1.0×107CFU/g，37℃下恒溫發酵20 h后按照1.3中工藝調配，活性乳酸菌飲料樣品中L.casei Zhang的活菌數達到3.0×108CFU/g以上，且在4℃ 28 d貯藏期內保持高于3.0×108CFU/g水平。

由圖1(b)可知，貯藏期內L.casei Zhang+B.animalis V9(1∶1，2.0×107CFU/g)活性乳酸菌飲料樣品中總的益生菌活菌數可以達到5.0×108CFU/g以上，其中L.casei Zhang的初始活菌數約為3.7×108CFU/g，且在4℃ 28 d貯藏期內保持高于3.7×108CFU/g水平;B.animalis V9的活菌數在貯藏期內呈逐漸增加的趨勢，第28天增加至2.7×108CFU/g。說明B.animalis V9與L.casei Zhang共同發酵發生協同效應，B.animalis V9的添加可促進 L.casei Zhang的增殖。

由圖1(c)可知，貯藏期內L.casei Zhang+B.animalis V9(1∶1，1.0×107CFU/g)活性乳酸菌飲料樣品中總的益生菌活菌數可以達到3.5×108CFU/g以上，其中L.casei Zhang的初始活菌數約為2.5×108CFU/g，后期逐漸減少，第28天時最低約為2.0×108CFU/g;B.animalis V9的活菌數在28 d貯藏期內保持約1.5×108CFU/g水平穩定不變。

由圖1(d)中結果可知，貯藏期內L.casei Zhang+B.animalis V9(1∶1，0.5×107CFU/g)活性乳酸菌飲料樣品中總的益生菌活菌數小于3.0×108CFU/g，其中L.casei Zhang的初始活菌數約為2.5×108CFU/g以上，后期逐漸減少，第28天時最低約為1.5×108CFU/g;B.animalis V9的活菌數在28 d貯藏期內保持約0.5×108CFU/g水平穩定不變。

2.3 不同活性乳酸菌飲料樣品感官評價結果

組織11名專業感官評價人員按照表2中標準對6種不同活性乳酸菌飲料進行感官評定，結果見表5。

由表5可以看出，將L.casei Zhang與B.animalis V9按照活菌數1∶1復配，總活菌數添加量為2.0×107CFU/g時，制備的活性乳酸菌飲料在口感和滋氣味方面更有優勢。

表5 不同活性乳酸菌飲料樣品感官評價結果Table 5 Sensory evaluation result of differentactive lactobacillus beverage samples

3 討論

目前市場上的活性乳酸菌飲料幾乎都是通過干酪乳桿菌單株菌長時間發酵調配而成的，國內該類產品的產量逐年攀升，養樂多、味全、蒙牛、伊利相繼推出該類產品［15］。貨架期內酸度、風味及乳酸菌活菌含量是活性乳酸菌飲料產品質量高低評價的重要指標。研究結果顯示:

(1)當總乳酸菌添加量為2.0×107CFU/g時，發酵乳基質的pH值可達到理想值4.00。

(2)利用L.casei Zhang單獨發酵制備活性乳酸菌飲料的最適添加量為1.0×107CFU/g，4℃ 28 d貯藏期內保持高于3.0×108CFU/g水平。

(3)最佳復配發酵組合為L.casei Zhang+B.animalis V9(1∶1，2.0×107CFU/g)，4 ℃ 28 d貯藏期內樣品中總的益生菌活菌數保持5.0×108CFU/g以上，且在口感和滋氣味方面感官評價分值最高。

由此可見，益生菌L.casei Zhang和B.animalis V9適合用于活性乳酸菌飲料產品的開發，2株菌在共同發酵過程中會發生協同效應，B.animalis V9的添加可促進L.casei Zhang的增殖，且有利于改善L.casei Zhang單株發酵樣品的感官品質。

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