發(fā)酵法制備L-鳥氨酸苯乙酸鹽的結晶工藝

丁俊峰，朱超，黃志旭，萬紅貴

1(南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，江蘇南京，210009)

2(南京工業(yè)大學國家生化中心，江蘇南京，211816)

L-鳥氨酸苯乙酸鹽(L-ornithine phenylacetate，OP)是由L-鳥氨酸與苯乙酸以離子鍵形式結合形成的，在食品工業(yè)上可作為配制草莓、啤酒、桃、巧克力、煙等型香精，也可作為酸性香料，是蜂蜜香精的主要成分，在保健品方面也有很多顯著的功能。如今，人們蛋白質的食用量大大增加，導致了人體氨的含量比較高，氨對人體的神經具有較強的毒害作用，OP中的L-鳥氨酸可以加速人體內的尿素循環(huán)，把氨排除體外，使人體處于理想狀態(tài)，所以也可用于肝性腦病和高血氨癥的防治［1-4］。OP亦具有解酒、改善睡眠的質量、緩解生理疲勞等功能。

目前國內外涉及OP制備的文獻很少，僅有的制備方法工藝復雜、路線繁瑣，且引入了銀離子等重金屬離子［5］。本研究直接以L-鳥氨酸發(fā)酵液為原料，通過預處理除去絕大部分的雜質及色素等，再用溶析結晶法制備，重點考察了晶種加入時機、晶種加入量、乙醇滴加速率及攪拌速率對結晶過程和產品質量的影響。由于該制備路線與L-鳥氨酸鹽酸鹽的制備路線部分重合［6-7］，因此將L-鳥氨酸發(fā)酵生產與OP制備進行偶聯(lián)，能有效縮短流程，減少排放，降低制備成本。本研究初步考察了用發(fā)酵液制備OP的方法，為工業(yè)生產提供了幫助。

1 儀器與試劑

2000型高效液相色譜儀，Alltech公司;膜分離裝置，南京工業(yè)大學膜科所;TiO2管式陶瓷膜，海得科公司，有效長度600 mm、有效面積0.022 5 m2、截留相對分子質量5×105;DDSJ-308A電導率儀，上海精密科技儀器有限公司;MasterSizer 2000型激光粒度分析儀，英國馬爾文儀器有限公司;D8 advance型X-射線粉末衍射儀，德國布魯克科技有限公司。

L-鳥氨酸發(fā)酵液，山東淄博金陽制藥有限公司，L-鳥氨酸含量為38.6 g/L，pH 6.8，殘?zhí)呛?.62 g/L，批號201302012;苯乙酸(分析純)，Sigma公司;OP，自制，將粗品經多次重結晶獲得，照測得純度≥99.5wt%;NH4+型JK006型陽離子交換樹脂，上海華震科技有限公司。

2 實驗方法

2.1 發(fā)酵液預處理

取L-鳥氨酸發(fā)酵液3 L，用濃HCl調pH至2.5，通過膜分離裝置(采用TiO2管式陶瓷膜)，在60℃、pH 2.5、操作壓差0.22 MPa條件下過濾2 h，除去發(fā)酵液中的菌體和大部分蛋白質。取過膜后的L-鳥氨酸清液1 L，用濃HCl調至pH 2.0，采用JK006型陽離子交換樹脂柱(3 cm×20 cm，濕法填裝樹脂100 mL)進行脫色除雜，流速為8 mL/min。上柱體積為470 mL時離子交換樹脂達到飽和吸附，停止上柱，用純水以10 mL/min的流速洗雜，至電導值低于150 μs/cm時改用1 mol/L氨水以8 mL/min的流速洗脫，收集pH值為9～11的洗脫液。將該洗脫液旋蒸去氨后，加入活性炭(8 g/L)，45℃下脫色處理30 min，最后過濾得L-鳥氨酸水溶液，濃縮至目標濃度，備用，最終L-鳥氨酸的收率為87.3%。

2.2 OP粗品的制備

取上述質量濃度為100 g/L的L-鳥氨酸溶液500 mL，加入苯乙酸51.5 g，攪拌使其充分反應后，濃縮至100 mL，25℃下加入6倍體積的無水乙醇析晶，冷卻至10℃以提高收率，抽濾并用少量冷乙醇淋洗，45℃減壓干燥得OP粗品95.63 g，純度為83.2wt%，收率為87.81%。

2.3 OP晶種的制備

將OP粗品30 g溶于30 mL水中，25℃下向體系中滴加無水乙醇并不斷攪拌，控制乙醇滴加速率為0.1 mL/min、攪拌轉速為150 r/min。30 h后停止滴加(共加入180 mL乙醇)，抽濾烘干得OP晶體27.8 g，過篩，選取粒徑在0.125～0.15 mm的晶體作晶種。

2.4 OP晶體的制備及質量評價

2.4.1 OP晶體的制備

取質量濃度約800 g/L的OP水溶液50 mL，置于結晶器中，25℃下恒速攪拌，用恒流泵勻速滴加無水乙醇，調整乙醇與OP溶液的體積比，添加晶種，攪拌養(yǎng)晶2 h后，調整乙醇滴加速率，以維持適宜的過飽和度使晶體生長。當乙醇與初始結晶液的體積比達到6∶1時，停止加入乙醇，繼續(xù)攪拌養(yǎng)晶2 h，并降溫至10℃，減壓抽濾，分離得OP晶體樣品。每次平行試驗3次，測定OP晶體的純度和平均粒徑。

2.4.2 OP純度及收率的計算

將待測OP在40～60℃下減壓干燥12 h，再配制成2 mg/mL的水溶液，分別檢測水溶液中L-鳥氨酸和苯乙酸的含量，換算得到OP的純度。

L-鳥氨酸的含量采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射(HPLC-ELSD)法［8］。色譜條件:色譜柱 Prevail C18柱(4.6 mm×250 mm，5μm);流動相 0.14%三氟乙酸水溶液(含0.06%七氟丁酸)∶乙腈=4∶1;ELSD檢測器N2流速2.0 mL/min，漂移管溫度110℃;流速0.8 mL/min;柱溫 25℃;進樣量 20 μL。本法線性范圍為0.1～1.2 mg/mL。

苯乙酸的含量采用高效液相色譜-紫外(HPLCUV)法［9］。色譜條件:色譜柱 Alltech Prevail C18柱(4.6 mm × 250 mm，5μm)，流 動 相 0.1 mol/L KH2PO4溶液∶水∶乙腈 =50∶30∶20，檢測波長 230 nm，柱溫 30℃，流速 1 mL/min，進樣量 20 μL。本法線性范圍為0.1～1.2 mg/mL。

OP的純度(C)和收率(Y)計算:

式中:m1和m2為終產品中實際測得的L-鳥氨酸和苯乙酸的質量，g;M為待測終產品總質量，g;M1和M2為結晶液中測得的L-鳥氨酸和苯乙酸的質量，g。

2.4.3 OP晶體的外觀和粒徑

取少量樣品置載玻片上，滴加2～3滴無水乙醇，蓋上蓋玻片，用光學顯微鏡觀察并拍照。采用激光粒度分析儀測定樣品粒度。

3 結果與討論

3.1 OP在水-乙醇體系中的溶解度

在純水及乙醇體積分數分別為0，10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%和 90%的乙醇-水溶液中分別加入過量的OP，25℃攪拌(轉速200 r/min)12 h后取樣，經0.25 μm微孔濾膜過濾。濾液用純水稀釋后照“2.4.2”項下方法用HPLC測定體系中L-鳥氨酸和苯乙酸的濃度，二者的濃度之和即為L-鳥氨酸苯乙酸鹽的溶解度，每個樣品測3次，取均值。結果見圖1。

圖1 OP溶解度曲線Fig.1 The solubility curve of oP

根據溶解度曲線特點，可將溶解度曲線上乙醇體積分數為0～20%區(qū)間劃分為Ⅰ區(qū)20%～70%為Ⅱ區(qū)、70%～90%為Ⅲ區(qū)。從圖1可見，在Ⅰ區(qū)、Ⅲ區(qū)乙醇引起的OP溶解度變化不大;當乙醇體積分數為20%～70%時，單位體積乙醇形成的過飽和度較大。從理論上分析，假設在結晶過程中晶體生長速率不變，那么在Ⅱ區(qū)的乙醇滴加速率應該最小，以保持體系合理的過飽和度，避免引發(fā)爆發(fā)成核;為提高生產效率，則應在I區(qū)和Ⅲ區(qū)適當加快乙醇滴加速率。

3.2 OP結晶工藝的確定

3.2.1 晶種加入時機對結晶質量的影響

攪拌速率為200 r/min，當乙醇流加量與初始結晶液體積比為R時，添加4wt%晶種，攪拌養(yǎng)晶2 h后調整乙醇滴加速率為0.8 mL/min，其他操作同“2.4”節(jié)。考察所得OP晶體純度(P)和平均粒徑(D)，確定晶種加入時機的影響，結果如圖2所示，晶體顯微照片見圖3。

圖2 添加晶種的時機對純度和平均粒徑的影響Fig.2 Effect of the adding time of seed crystals on purity and average diameter of crystals

圖3 不同投加晶種時機所得OP晶體的顯微照片Fig.3 The micrographs of crystalline OP prepared at different times of adding seed crystals

結果表明，過早添加晶種時由于溶液未達到最佳過飽和度，晶種無法起作用，甚至直接被溶解。當R＞0.4時，最終結晶產品反而細小且純度相對較低，這主要是因為此時溶液過飽和度較大，越過介穩(wěn)區(qū)，進入不穩(wěn)區(qū)，形成初級均相成核，出現暴晶。當R約為0.4時，溶液的過飽和度剛好，晶種的加入及時降低了過飽和度，避免了初級均相成核現象，晶體顆粒較大，純度較高。因此選擇乙醇與起始結晶液體積比為0.4時為最佳投加晶種時機。

3.2.2 晶種加入量對結晶質量的影響

乙醇滴加量與初始結晶液體積比為0.4時加入晶種，其他操作同“2.6.1”節(jié)。考察晶種加入量對晶體純度(P)和平均粒徑(D)的影響。結果見圖4。

結果表明，當晶種加入量為4%時，所得產品的純度最高，平均粒徑最大。晶種加入量過多或過少均不利于得到純度高、粒度大的產品。原因是晶種加入量太少時難以避免溶析結晶過程中高過飽和度下的自發(fā)成核，使產品平均粒徑減小、純度降低;加入量過多時生長單元(即溶質溶度)相對于生長點少，導致平均粒徑變小，并且在工業(yè)生產中也不經濟。所以選擇4%晶種投加量為最優(yōu)值。

圖4 投加晶種的量對純度和平均粒徑的影響Fig.4 Effect of the amount of seed crystals on purity and average diameter

3.2.3 乙醇滴加速率對結晶質量的影響

乙醇添加量與初始結晶液體積比為0.4時加入4wt%的晶種，其他操作同“2.6.1”節(jié)，考察乙醇滴加速率對晶體純度(P)和平均粒徑(D)的影響，結果見圖5，晶體顯微照片見圖6。

圖5 乙醇滴加速率對純度和平均粒徑的影響Fig.5 Effect of dropping speed of ethanol on purity and average diameter

圖6 不同乙醇流加速率得到晶體的顯微照片Fig.6 The micrographs of crystalline OP obtained under different dropping speeds of ethanol

結果表明，隨著乙醇滴加速率的增加，剛開始晶體的純度和平均粒徑變化不大。但當乙醇流速超過0.8 mL/min時，純度和平均粒徑迅速減小，這是因為當滴加速率超過0.8 mL/min時，體系中溶質的濃度增加值大于結晶速率，過飽和度不斷增加，出現均相成核的幾率增多，從而形成更多的細小晶體［10］(見圖6b)，同時母液中的雜質及色素包藏于晶體中，影響晶體的平均粒徑和純度。考慮到生產效率應盡可能增大滴加速率，因此滴加速率選擇0.8 mL/min。

3.2.4 攪拌速率對結晶質量的影響

乙醇添加量與初始結晶液體積比為0.4時，加入4wt%的晶種，調節(jié)乙醇流加速率為0.8 mL/min，其他操作同“2.4”節(jié)，考察攪拌速率對晶體純度(P)和平均粒徑(D)的影響，結果見圖7，晶體顯微照片見圖8。

圖7 攪拌速率對純度和平均粒徑的影響Fig.7 Effect of stirring rate on purity and average diameter

圖8 不同攪拌速率得到晶體的照片Fig.8 The micrographs of crystalline prepared at different stirring rates

結果表明，攪拌速率過低時既影響平均粒徑又降低純度，這是因為它不能滿足結晶過程對懸浮液混合均勻的要求，嚴重影響物質傳遞和熱量傳遞，使結晶過程不能順利進行，晶體生長不良。而攪拌速率過高時，易加劇晶體之間、晶體與容器壁、晶體與攪拌槳葉之間的碰撞概率而形成細晶，降低平均粒徑(見圖8a)。綜合考慮，最佳攪拌速率應選擇適中數值(200 r/min)。

3.2.5 驗證試驗

為確定單因素實驗結果的可靠性，進行驗證試驗。采用上述優(yōu)化條件照“2.4”節(jié)方法進行操作，重復試驗3次，所得OP晶體平均純度(98.3±0.32)wt%，平均粒徑(614.7±2.2)μm，平均總收率(72±1.6)%。

3.3 OP晶體的X-射線粉末衍射分析(XRPD)

采用X-射線粉末衍射檢測制備的晶體，檢測條件:X-射線源，Cu Kα1(波長為0.154 056 nm)，工作電壓 40 kV，工作電流強度 40 mA，掃描角度4～50°，2θ步長值 0.05°，掃描速度 1 s/步，結果見圖9。文獻［11］報道OP的X-射線粉末衍射圖中特征峰(2θ)為5.6、13.9、17.1、24.1、28.5 和 32.3 °，本試驗制得的晶體特征峰出現的位置為5.58、17.09、24.12、28.44和32.26°，與文獻圖譜基本一致，各衍射峰強度比例基本相同，因此判斷所得晶體為OP晶體。

圖9 OP晶體的X-射線粉末衍射圖Fig.9 XRPD pattern of crystalline OP

4 結論

本研究首先測定了OP晶體在不同濃度乙醇中的溶解度，為結晶工藝提供依據;然后考察了結晶條件對結晶過程及產品質量的影響，得到了較優(yōu)工藝;最后對晶體進行XPRD，并與文獻圖譜比較，確定該晶體為OP晶體。

目前國內外主要以L-鳥氨酸鹽酸鹽為原料，經預處理得到L-鳥氨酸，再與苯乙酸反應得到OP。本文提出由發(fā)酵液直接制備OP，旨在繞開發(fā)酵法生產L-鳥氨酸工藝中的提取過程。而該過程與OP的制備工藝部分重復，尤其是離子交換過程，此外還包括L-鳥氨酸鹽酸鹽的結晶，干燥等過程。為縮短工藝流程，降低能耗，提高原料及設備利用率，采用L-鳥氨酸發(fā)酵液制備OP是必要的，通過實驗發(fā)現該法也是可行有效的。考慮到溶析結晶乙醇消耗量過大的問題，采用了后期降低溫度以提高收率的方法，減少了乙醇的使用量，且乙醇可減壓蒸餾回收。另外，在結晶母液中存留不少產品成分，工業(yè)生產中需要考慮回收利用，有關問題有待進一步研究。

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