鹽脅迫對枯草芽孢桿菌發(fā)酵代謝產物的影響*

劉陽，鄧靜，吳華昌，張建軍，龔加路，鄭濱，陳建

1(四川理工學院，四川 自貢，643000)2(四川旅游學院，四川 成都，610100)

微生物生長在高鹽環(huán)境下受到高滲透勢的影響稱為鹽脅迫，因此其實質為滲透脅迫，當鹽脅迫高到足以改變水勢，微生物的生理代謝機制也會發(fā)生相應的變化，從而影響代謝產物的生成。鹽脅迫下細胞為了進行正常的生理代謝活動，能夠產生一系列應答機制，主要表現在:(1)鹽脅迫蛋白的表達［1］，主要包括抗氧化蛋白、膜相關轉運蛋白或逆轉運蛋白等;(2)鹽離子的區(qū)隔化［2］，主要是通過位于膜上的“泵”進行離子跨膜運輸完成的;(3)合成和積累相容性溶質［3］，如甜菜堿、氨基酸等以提高細胞內水活度，使細胞的體積和膨壓達到正常水平，避免細胞內所有物質濃度的升高。酵母細胞中常見的相容性溶質為甘油和海藻糖［4］，細菌中常見的為四氫嘧啶和甜菜堿等［5］。

目前，隨著鹽脅迫下細胞的響應機制等影響的進一步加深，研究人員逐漸轉變方向，開始采用代謝組學、蛋白質組學、比較基因組學等手段深入研究鹽脅迫對細胞代謝的影響。Schroeter［6］等的研究表明，滲透壓正調節(jié)基因在功能上和能夠減輕滲透壓的化合物(相容性介質)的合成和輸出、控制一般應激反應的sigB等方面相關。地衣芽孢桿菌轉錄組學相關的數據集因細胞遭受滲透壓脅迫合成增加從而積累的蛋白質組學而豐富。Choi［7］等的研究表明高鹽環(huán)境下OJ82的β-半乳糖苷酶活性和胞外蛋白酶的活性最高，且復制起點高度保守，高鹽濃度下的RNA序列分析表明與細胞膜、轉運、滲透壓、ATP合成和翻譯相關的基因都高度表達。然而這些研究大都集中于理論機制的研究，對基于中心碳代謝的具體產物方面的研究有所欠缺。

本研究從甜面醬中篩選出1株優(yōu)良枯草芽孢桿菌，利用氨基酸自動檢測儀和頂空固相微萃取氣質聯用技術檢測了不同鹽濃度下枯草芽孢桿菌代謝產物的含量和種類，結合基質消耗、菌體生長和相關副產物的生成情況，探討了鹽脅迫對具體產物合成的影響，從而為深入研究不同環(huán)境下細胞能量代謝和特定產物生成的生理機制提供參考，并為芽胞桿菌在甜面醬發(fā)酵過程中的代謝機理提供參考方向，對甜面醬生產和發(fā)酵工藝的改良具有指導意義。

1 材料和方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基

菌株:從四川地區(qū)自然發(fā)酵甜面醬中篩選得到的產香枯草芽孢桿菌菌株B.subtilis B15。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5，pH 7.4～7.6;發(fā)酵培養(yǎng)基1(g/L):葡萄糖20，蛋白胨15，牛肉膏0.5，NaCl 5，自然 pH;發(fā)酵培養(yǎng)基2(g/L):葡萄糖20，蛋白胨15，牛肉膏0.5，NaCl 50，自然pH;發(fā)酵培養(yǎng)基3(g/L):葡萄糖20，蛋白胨15，牛肉膏0.5，NaCl 100，自然pH;發(fā)酵培養(yǎng)基4(g/L):葡萄糖20，蛋白胨15，牛肉膏0.5，NaCl 150，自然pH。

1.2 主要設備和藥品

3，5-二硝基水楊酸，成都科龍化工試劑廠;對羥基聯苯，奧中化工有限公司。試劑均為分析純。

萃取頭(50/30 μm DVB/AR/PDMS)、氣相色譜質譜聯用儀(Agilent 6890-5975)，美國安捷倫公司;全自動氨基酸分析儀(L-8900)，日本日立公司。

1.3 發(fā)酵方法

鹽濃度耐受性檢測:將B.subtilis B15接種至含NaCl質量濃度分別為5、50、100、150 g/L 的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基平板上(以NaCl質量濃度為5 g/L的培養(yǎng)基做對照)，恒溫培養(yǎng)24～48 h(37℃)，觀察菌株是否能夠生長，從而確定合適的鹽濃度梯度［8］;同樣的方法做菌株在液體培養(yǎng)基中的鹽濃度耐受性實驗。

種子液的制備:在確定菌株生長適宜的鹽濃度梯度的基礎上，進行發(fā)酵實驗。從新鮮斜面培養(yǎng)基上挑取1環(huán)枯草芽孢桿菌接入到500 mL搖瓶中(種子培養(yǎng)基裝液量為100 mL)，于恒溫振蕩搖床上37℃培養(yǎng)24 h(轉速150 r/min)，即得種子液。

搖瓶培養(yǎng):以5%接種量將種子液分別接入不同鹽濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行搖瓶培養(yǎng)，搖床轉速設為170 r/min，溫度為37℃，每隔12 h取樣備用。

1.4 測定方法

1.4.1 理化指標

葡萄糖:DNS 法［9］;生物量:干重法［10］;淀粉酶活力測定:DNS比色法［11］;乳酸:對羥基聯苯比色法［12］。實驗數據至少取2次獨立實驗的平均值，用origin8.0軟件作圖分析。

1.4.2 氨基酸種類和含量的測定

一個樣品分析周期約60 min，分析儀有2個流路和2根柱，即:(1)分離柱(4.6 mm×60 mm)洗脫液流經此柱，流速 0.4 mL/min，柱溫 700℃，柱壓13.098 MPa;(2)反應柱:茚三酮及茚三酮緩沖液流經此柱，流速0.35 mL/min，柱溫135℃，柱壓1.078 MPa。對照樣品:日立公司產17種氨基酸混合標樣。

1.4.3 揮發(fā)性香氣成分測定

1.4.3.1 萃取方法

準確量取6 mL發(fā)酵液于15 mL頂空瓶中恒溫水浴(60℃)，加入NaCl 0.5 g，調節(jié)轉速為600 r/min，將50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭平衡5 min后吸附30 min，然后將萃取頭移入氣相色譜的高溫汽化室中解吸3 min，進行GC-MS分析，測定B15發(fā)酵液中的揮發(fā)性風味物質［13］。

1.4.3.2 檢測條件

色譜條件:毛細管色譜柱為 DB-WAX，規(guī)格為(60 m ×250 μm，0.25 μm);手動無分流進樣，進樣口溫度250℃;程序升溫:初始溫度為45℃，保留1 min，以3℃/min的速率升至180℃，再以2.5℃/min的速率升至230℃，保留10 min;汽化室溫度250℃;載氣 He，流速1 mL/min。

質譜條件:EI電離源，電子能量70 eV，掃描范圍20～500 u，離子源溫度250℃;接口溫度230℃。

1.4.3.3 數據處理

由GC-MS數據分析軟件系統完成，未知化合物經計算機檢索同時與NSIT譜庫和RTLPEST譜庫相匹配，僅當匹配度大于800(最大值為1 000)的鑒定結果才予以報道。采用峰面積歸一化法定量計算出各揮發(fā)性成分在甜面醬中的相對含量。

2 結果與分析

將B.subtilis B15分別接種至NaCl質量濃度為5、50、100、150 g/L 的固態(tài)培養(yǎng)基和相同 NaCl質量濃度的液態(tài)培養(yǎng)基中，結果表明，B.subtilis B15能夠在NaCl質量濃度為150 g/L的平板培養(yǎng)基上生長，但無法在150 g/L的NaCl液態(tài)培養(yǎng)基中生長，可能是因為鹽脅迫相關基因在固體瓊脂平板上和液體培養(yǎng)基中的表達水平存在差異。研究表明，鹽脅迫刺激sacB基因(編碼果聚糖蔗糖酶)的表達，抑制aprE(編碼堿性蛋白酶)基因的表達，而sacB受環(huán)境影響較大，在固體瓊脂平板上的表達水平是液體培養(yǎng)基的8倍［14］。因此將發(fā)酵實驗中的NaCl質量濃度梯度選定為 5、50、100 g/L。

2.1 不同鹽濃度下發(fā)酵過程中理化指標的變化

發(fā)酵液中逐漸增加的鹽濃度顯著影響B(tài).subtilis B15的代謝活動，通過基質消耗速率、細胞生長速率、相關代謝產物的生成直觀地表現出來。以NaCl質量濃度為5g/L時B.subtilis B15的菌體代謝活動為對照，分別測定了NaCl質量濃度為50 g/L和100 g/L時葡萄糖消耗情況、細胞干重變化、主要副產物乳酸生成和胞內淀粉酶的活力大小，結果如圖1所示。

圖1 B.subtilis B15發(fā)酵過程中殘?zhí)?、菌體干重、乳酸和淀粉酶活力的變化Fig.1 Change of reduced glucose，cell dry weight，lactic acid and amylase activity during B.subtilis B15 culture process

由圖1(A)和1(B)可得，B.subtilis B15在不同鹽濃度下葡萄糖的消耗呈現相同的變化趨勢，但不同時期消耗速率存在差異。發(fā)酵0～36 h 50 g/L NaCl質量濃度下B.subtilis B15迅速適應環(huán)境，且葡萄糖消耗速率與對照鹽濃度差異較小，但菌體干重明顯偏低，因此此階段中消耗的葡萄糖除了進行菌體生長以外，可能也用于合成某些能夠抵御高滲脅迫的相容性溶質。在這一時期100 g/L NaCl下B.subtilis B15菌體處于生長延滯期，葡萄糖消耗極慢，菌體干重緩慢增加。發(fā)酵48 h后細胞在50 g/L NaCl質量濃度下首先達到生長穩(wěn)定期，菌體干重達到最大(1.68 g/L)，此時發(fā)酵液中的殘?zhí)侵饕糜诋a物合成，持續(xù)至發(fā)酵84 h細胞衰亡，菌體干重降低(0.94 g/L)，而100g/L NaCl質量濃度下自發(fā)酵36 h后糖耗速率顯著增加至發(fā)酵結束，可能大部分葡萄糖用于代謝產物的合成，菌體干重始終最低。

由圖1(C)可知，隨著鹽脅迫強度的增加B.subtilis B15生成乳酸的趨勢保持一致，在發(fā)酵48 h達到最大(0.29、0.33、0.40 g/L)。在該時期細胞已經適應了高鹽濃度，乳酸大量生成使發(fā)酵液的pH降低，改變酸堿平衡，并對電子傳遞體系相關的能量代謝產生影響［15］。整個發(fā)酵過程中，B.subtilis B15在100 g/L NaCl質量濃度下無論是乳酸的生成速率還是消耗速率都高于其他鹽濃度，因此推測乳酸在細胞抗高滲脅迫過程中起重要作用，但更深層次的原因還有待探究。由圖1(D)可知，B.subtilis B15在鹽脅迫下正常合成并分泌淀粉酶。對照鹽濃度水平下胞內淀粉酶的活力在發(fā)酵0～24 h增加至最高值(2.54 U/mL)，此后下降至發(fā)酵60 h淀粉酶全部分泌到胞外;50 g/L NaCl質量濃度下的淀粉酶活力至發(fā)酵12 h已達到最大(3.44 U/mL)，此后下降至發(fā)酵72 h后檢測不到;100 g/L NaCl質量濃度水平下淀粉酶的活力相對較小，發(fā)酵12 h達到最大(1.47 U/mL)，此后一直下降至發(fā)酵60 h后檢測不到，因此分泌到胞外的淀粉酶在發(fā)酵末期才能夠檢測得到，且適當增加發(fā)酵液的鹽濃度更有利于β-淀粉酶的產生，與蒙健宗的結論相符［16］。

2.2 不同鹽濃度下氨基酸種類和含量的變化

在枯草芽孢桿菌代謝體系中，大部分氨基酸是以EMP途徑與檸檬酸循環(huán)的中間物——草酰乙酸和α-酮戊二酸等為碳鏈骨架生物合成的。而芳香族氨基酸的生物合成與HMP途徑中的4-磷酸赤蘚糖有關，組氨酸的合成與PRPP(5-磷酸核糖-α-焦磷酸)有關。氨基酸在微生物細胞調節(jié)滲透壓過程中發(fā)揮重要作用，Akira等認為高含量的甘氨酸導致了相容性溶質——游離氨基酸和甜菜堿類物質的大量產生［17］。研究不同發(fā)酵時期氨基酸的變化，對監(jiān)測鹽脅迫對具體氨基酸代謝途徑的影響具有重要意義。B.subtilis B15發(fā)酵過程中氨基酸種類和含量的變化見表1。

不同鹽濃度下B.subtilis B15共產生10種氨基酸，按照代謝前體及途徑的差異將其分為4類:第1類為 Asp、Lys、Thr、Met和 Ile，第 2 類為 Ser、Gly 和Cys，第3類為His，第4類為Phe。第1類氨基酸中Asp、Met和Ile僅在10%鹽濃度下檢測到，且發(fā)酵24 h濃度最大，隨發(fā)酵過程濃度降低，Lys的濃度隨著鹽脅迫增強出現不同程度的增加，因此100 g/L NaCl濃度刺激了Asp的合成與相關轉化。第2類氨基酸中不同鹽濃度下發(fā)酵液中Ser的濃度顯著降低，Gly濃度發(fā)酵末期小幅上升，Cys參與丙酮酸的合成，高鹽濃度濃度增加，因此鹽脅迫抑制了Ser的積累，且對His和Phe的積累影響不大。

表1 B.subtilis B15發(fā)酵過程中氨基酸種類和含量的變化Table 1 Change of amino acid during B.subtilis B15 culture process

2.3 不同鹽濃度下揮發(fā)性風味成分的變化

B.subtilis B15發(fā)酵過程中產生的揮發(fā)性風味成分的色譜峰面積如表2所示。不同鹽濃度下發(fā)酵液中揮發(fā)性成分的種類和含量存在較大差異。其中不同鹽濃度的不同發(fā)酵周期都能檢測到的是3-羥基-2-丁酮，一種具有強烈奶油香氣的常見化合物，通過α-乙酰乳酸或2，3-丁二酮直接形成，還可以與2，3-丁二醇相互轉化。但發(fā)酵液僅僅檢測到極少量2，3-丁二酮，因此鹽脅迫可能刺激了α-乙酰乳酸脫羧酶或丁二酮還原酶的大量表達，從而導致3-羥基-2-丁酮大量積累。僅在10%鹽濃度發(fā)酵液能夠檢測到的物質有4種，分別為三氯甲烷、正己醛、正己醇和糠醛，均為常見小分子香氣成分，但含量均較低且隨著發(fā)酵的進行檢測不到，因此高鹽濃度下縮短發(fā)酵時間有利于該類物質的積累。僅在對照鹽濃度(5 g/L NaCl)發(fā)酵過程中能夠檢測到的物質有4種，分別為乙酸乙烯酯、甲氧基異戊酸乙酯、戊酮和異辛醇，均僅在某一發(fā)酵周期存在且含量較低。2，5-二甲基吡嗪是是一種烷基吡嗪類香料，在食品中只添加1～2 mg/L，就能起到明顯的增香作用［18］，本實驗中在50 g/LNaCl脅迫下，以葡萄糖為單一碳源的基礎培養(yǎng)基中發(fā)酵96 h，能夠檢測到少量該物質的產生，說明枯草芽孢桿菌中存在2，5-二甲基吡嗪的代謝途徑，可能是不良環(huán)境條件激活了相關基因的表達。苯甲醛是最簡單的芳香醛，是常見的醫(yī)藥、香料、染料合成中間體，50 g/L和100 g/L NaCl濃度下微量產生。

表2 B.subtilis B15發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分色譜峰面積的變化Table 2 Change of volatile flavor components during B.subtilis B15 culture process

3 討論

本實驗利用頂空固相微萃取-氣質聯用技術檢測了不同鹽濃度下發(fā)酵液中的揮發(fā)性風味成分，其中三氯甲烷、正己醛等4種物質僅在高鹽脅迫(100g/L NaCl)下產生，且大部分為醛醇等不穩(wěn)定的化合物，因此從代謝機理上存在兩種可能，高鹽脅迫刺激了其相關基因的表達，或是抑制了該類化合物的完全轉化。氨基酸分析表明這一階段中草酰乙酸途徑產物表達差異顯著，且產物合成周期一致，二者在代謝途徑和基因方面是否具有關聯性還有待進一步研究。

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