冷卻牛肉中沙門氏菌生長預測模型的建立和驗證*

鄭婷，董鵬程，王仁歡，張一敏，梁榮蓉，毛衍偉，朱立賢，羅欣

(山東農業大學食品科學與工程學院，山東 泰安，271018)

沙門氏菌(Salmonella)屬腸桿菌科，革蘭氏陰性，兼性厭氧菌，包括鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌和腸炎沙門氏菌等［1］。在世界范圍內，危害公共健康的致病菌中沙門氏菌占據重要地位［2-3］。據估計，全球每年約有2億～13億人感染沙門菌，造成約300萬人死亡［4］;美國每年因沙門氏菌感染患病約有140萬人，約400人因此而喪生［5］;在我國，細菌性食物中毒中有70%～80%是由沙門氏菌引起的，其中90%以上的沙門氏菌感染都是由肉類動物性食品引起［6］，尤其是畜肉類及其肉制品最易感染沙門氏菌［7］。

冷卻牛肉正以滋味鮮美、口感細膩及營養價值高等優點，代表了生鮮牛肉的生產和消費的發展方向［8］。但其營養豐富，水分活度高，極易受微生物的污染。在正常情況下，冷卻肉始終處于0～4℃低溫環境中，使沙門氏菌的生長受到了抑制。因此持續低溫流通是維持肉品質并保證微生物安全的最重要的方法。但我國冷鏈系統不完善，在其貯藏、運輸和流通過程中出現控制不當，從而使溫度經常異常波動，微生物會迅速繁殖，從而影響牛肉產品的安全，對人類健康和生命安全造成潛在威脅。

傳統的微生物檢測費時費力，而且結果往往具有滯后性，起不到預測的作用［9］。而應用微生物預測模型可以快速有效地對重要微生物的生長、存活和死亡進行預測，從而確保食品在生產、運輸、貯存等過程中的安全和穩定，是一種防止病原微生物對食品污染的有效的預警工具［10］。目前，已經建立了萵苣中、新鮮豬肉濾汁中和碎牛肉中沙門氏菌的生長動力學研究［11-13］，但是有關冷卻牛肉中沙門氏菌生長動力學模型方面的研究未見報道。因此，本實驗建立了不同恒溫條件下冷卻牛肉中沙門氏菌的生長模型，預測其在不同貯藏溫度下的生長動態，并驗證了模型的有效性，以期為在冷卻牛肉生產中更好地控制該菌提供有效的手段，以避免肉制品中沙門氏菌的污染和減少由于其污染而造成的食品安全問題。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

本實驗采用4株不同血清型的沙門氏菌混合菌株，分別是鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium ATCC14028)，腸炎性沙門氏菌(S.enteritidis)，阿貢沙門氏菌(S.agona)和德爾卑沙門氏菌(S.derby)，除第1株為標準菌株，其他3株均為山東農業大學畜產實驗室保存菌株。

1.1.2 主要試劑和儀器

Hektoen Enteric Agar HE瓊脂，購自北京陸橋技術有限責任公司;胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB)，購自北京陸橋技術有限責任公司;BagFilter-400拍打袋，購自法國Interscience公司;Bag Mixer-400W均質器，購自法國Interscience公司;HP-9272恒溫培養箱，購自上海一恒科學儀器有限公司;Gilson P200移液器，購自濟南莊盟生物技術有限公司;G154D立式自動壓力蒸汽滅菌器，購自廈門致微儀器有限公司;IKA VORTEX1圓周振蕩器，購自廣州艾卡儀器設備有限公司;Healsafe1200生物安全柜，購自法國力申科學儀器有限公司。

1.2 樣品處理及接種

1.2.1 樣品的準備

從山東省某肉牛屠宰公司無菌操作取背最長肌，冷藏(0～4℃)條件下3 h內帶回實驗室，紫外燈照射30 min去除外周及筋腱后，垂直于肌纖維方向切成25 cm2大小，厚約2 cm，重約25 g的肉塊。將每份肉樣裝入均質袋內并密封，冷藏備用。

1.2.2 菌懸液的制備

無菌條件下，將4株不同血清型的沙門氏菌分別平板劃線后挑取單菌落，分別接入TSB液體培養基中，37℃培養24 h，得到生長至穩定期的菌液，最終等量混合后備用。

1.2.3 接種

用無菌生理鹽水將活化后的菌液進行梯度稀釋，制成3～4 lg(CFU/mL)的菌懸液，把肉塊懸浮于其中15 min進行接種，置于無菌的倒扣鐵網上低溫下靜置2 h以去掉多余水分，然后分裝于無菌拍打袋中。

1.3 沙門氏菌生長曲線的測定

將接種后的肉樣置于 0、4、7、10、15 和 20 ℃恒溫培養箱中貯藏，每隔適當時間取出樣品進行微生物計數。在無菌條件下，每隔相應時間取不同溫度下的每組樣品(3個)相應肉樣25 g牛肉置于均質拍打袋中，加入225 mL 0.1%無菌蛋白胨水，以最大速度(9 h/s)充分拍打2 min。然后用無菌蛋白胨水對濾液進行10倍的梯度稀釋，取3個適宜梯度的稀釋液1 mL涂布于HE平板，37℃需氧培養24 h，計數結果進行對數轉換。

1.4 數據處理

實驗數據采用SAS 9.0統計軟件對選取的適當模型進行擬合和回歸。

1.5 數學模型的建立和驗證

1.5.1 沙門氏菌初級模型的建立

分別將在0、4、7、10、15 和20 ℃貯藏條件下接種的冷卻牛肉中得到的沙門氏菌生長的實驗數據擬合方程，用修正的 Gompertz方程［14-15］或 Linear方程［16］描述不同溫度下的生長動態。

(1)式中:t為貯藏時間，h;N(t)為t時的菌數，CFU/g;Nmax和N0分別為最大和初始菌數，CFU/g;μmax微生物生長的最大比生長速率，h-1;λ為微生物生長的延滯時間，h。

(2)式中，t為貯藏時間，h;D表示降低一個對數級所需要的時間，h。

1.5.2 溫度對沙門氏菌生長影響的動力學模型(二級模型)的建立

溫度對沙門氏菌生長影響的動力學模型用平方根(Ratkowsy)方程描述，是 Ratkowsky等［17］根據微生物在0～20℃溫度條件下，最大比生長速率(μmax)和遲滯期(λ)倒數的平方根與溫度之間存在線性關系，提出的一個數學模型，方程式如下:

式中T是培養溫度，℃;Tmin是最低生長溫度，指微生物沒有代謝活動時的溫度，即在此溫度下最大比生長速率為0，b是方程的常數。

1.5.3 沙門氏菌生長模型的驗證

(1)恒定溫度的驗證。應用建立的生長動力學模型求得9℃和12℃貯藏時的預測值，與冷卻牛肉中9℃和12℃貯藏實驗中實際的沙門氏菌生長數值進行比較，采用偏差度(Bias factor，Bf)和準確度(Accuracy factor，Af)來評價已經建立的沙門氏菌生長動力學模型的可靠性［18］。

式中N實測是實驗實際測得的微生物數量;N預測是應用生長動力學模型得到的與N實測同一時間的微生物數量;n是實驗次數。

(2)波動溫度的驗證。根據實際流通過程，按4℃24 h—10℃8 h—20℃1 h—4℃197 h的貯藏條件進行波動溫度條件下的驗證實驗，每隔適當時間取出樣品進行微生物計數。利用EGT原理［19-21］的得到的下面的方程結合恒定溫度的參數值，建立波動溫度的沙門氏菌生長模型，方程式如下:

同樣，將波動溫度下沙門氏菌生長預測值與實驗值進行比較，通過Bf和Af來評價所建模型在波動溫度下的可靠性。

2 結果與分析

2.1 牛肉中沙門氏菌的生長動力學模型的建立

根據沙門氏菌在恒定溫度下的計數結果，擬合Linear方程或修正的Gompertz方程，繪制了在不同溫度下的生長曲線，如圖1所示。

圖1 在0、4、7、10、15和20 ℃貯藏溫度下牛肉利用Modified Gompertz和Linear方程擬合的沙門氏菌的生長曲線Fig.1 Growth data and fitted Modified Gompertz curves and Linear curves of Salmonella on beef stored at 0，4，7，10，15 and 20 ℃

從圖1可以看出，除0℃下沙門氏菌的生長呈線性外，其他溫度下的生長曲線均呈良好的S型，并能由修正的Gompertz方程較好地擬合。根據沙門氏菌生長的實驗值，由修正的Gompertz方程或Linear方程回歸得到沙門氏菌在不同溫度下的生長動力學模型:

Linear方程:0℃ lg N(t)=2.799 2-0.002 71×t

修正的Gompertz方程:

4℃lg N(t)=1.942 9+1.293 1×exp(-exp(0.009 96×2.718/1.293 1× (104.2-t)+1))

7℃lg N(t)=1.863 9+3.383×exp(-exp(0.019 5×2.718/3.383 0× (50.723 0-t)+1))

10℃lg N(t)=2.014 2+4.043 1×exp(-exp(0.023 7×2.718/4.043 1× (23.101 6-t)+1))

15℃lg N(t)=2.118 1+6.101 4×exp(-exp(0.143 4×2.718/6.101 4× (8.675 6-t)+1))

20℃lg N(t)=2.030 0+6.783 7×exp(-exp(0.230 2×2.718/6.783 7× (4.044 2-t)+1))

2.1.2 沙門氏菌生長動力學模型的參數

表1是沙門氏菌在不同溫度下的生長動力學模型的參數。

由表2可知，溫度對沙門氏菌的生長有重要影響。在0～20℃范圍內，沙門氏菌的最大比生長速率(μmax)和遲滯期(λ)隨溫度不同而發生顯著變化，即沙門氏菌的生長速率和遲滯期與溫度密切相關。隨著溫度的逐漸升高，沙門氏菌的最大比生長速率(μmax)和最大菌落數(Nmax)不斷增大，而遲滯期(λ)不斷減小。可以看出，溫度是影響冷卻牛肉中沙門氏菌的重要環境因素，不管是生長速率還是遲滯期對溫度都有很強的依賴性。初始菌數(N0)比較穩定，是因為本實驗采用同一的接種過程導致的。用Linear線性方程來擬合0℃貯藏過程中得到的沙門氏菌生長實驗值，R2為0.909;用修正的Gompertz方程來擬合其他溫度下的沙門氏菌生長實驗值，R2在0.992到0.999之間，表明不同溫度下沙門氏菌的生長動力學模型擬合度較好，能準確可靠地預測冷卻牛肉中沙門氏菌的生長狀態。

表1 牛肉在0、4、7、10、15和20℃貯藏中的初始的沙門氏菌數、最大菌數、最大比生長速率、遲滯期、RMSE和R2Table 1 Initial Salmonella number(N0)，maximum cell number(Nmax)，Maximum specific growth rate(μmax)、lag phase(λ)，Mean Square Error，and R2modelled by Modified Gompertz(Linear)of beef stored at 0，4，7，10，15 and 20 ℃

2.2 溫度對沙門氏菌生長動力學參數的影響(二級模型的建立與驗證)

2.2.1 二級模型的建立

由上述分析可知，Gompertz方程能很好地預測在4～20℃溫度下沙門氏菌的生長，但卻無法描述溫度的變化對沙門氏菌生長的影響，而在冷卻牛肉的實際加工處理和貯藏過程中，冷藏的溫度往往不斷發生變化。因此對于溫度對微生物生長的影響選用平方根模型(Ratkowsy方程)描述。圖2表示用Ratkowsy方程描述的溫度與最大比生長速率(μmax)和溫度與延滯時間(λ)的關系。

圖2 溫度與最大比生長速率及與延滯期的關系Fig.2 Relationship between temperature and maximum specific growth rate，also with lag phase

由圖2可看出，溫度與μmax及λ間均呈現良好的線性關系，溫度與μmax及λ間的平方根方程分別為:兩方程的R2值分別為0.962和0.986，表明在0～20℃范圍內溫度與及的線性關系是可信的。

2.2.2 二級模型的可靠性評價

對沙門氏菌平方根模型的可靠性進行評價，沙門氏菌最大比生長速率平方根的殘差見圖3。

圖3 沙門氏菌生長速率平方根的殘差分析圖Fig.3 Residual graph(μobserved1/2-μpredicted1/2):comparison of predicted value and observed value

由圖3可知，沙門氏菌平方根模型的殘差值均落在±0.045范圍內，殘差絕對值小于0.05，因此所對應觀測值都比較可信。因此應用平方根模型能夠很好的描述不同溫度對沙門氏菌生長的影響［22］。

表2是根據溫度與λ及μmax平方根模型得到的實驗值和預測值，從中可以看出，沙門氏菌生長速率平方根的殘差和遲滯期倒數的平方根的殘差值均在±0.05范圍內，因此可認為該模型在α=0.05的水平上是可信的。

表2 溫度與延滯時間(λ)及最大比生長速率(μmax)平方根模型的殘差值Table 2 Residuals of square-root model of temperature with lag time and maximal specific growth rate

2.3 沙門氏菌初級模型的驗證

2.3.1 恒定溫度下的驗證

表3是冷卻牛肉在9℃和12℃溫度下沙門氏菌的實驗值與利用模型計算得到的預測值比較，得到預測方程的偏差度(Bf)和準確度(Af)。由此可知，預測值上下波動的幅度和誤差均在10%左右，表明本研究中建立的預測模型能有效預測牛肉在不同恒定溫度條件下沙門氏菌的生長情況。

2.3.2 波動溫度下的驗證

根據EGT的假設原理，利用修正的Gompertz方程擬合出波動溫度下沙門氏菌的生長模型并繪制了生長曲線，如圖4所示。

從圖4可以看出，在設計的波動溫度條件下，沙門氏菌的預測生長曲線與實測生長曲線走勢相同，生長曲線呈“S”型，表明評價模型擬合效果較好。由表3可知，波動溫度下的準確度Af和偏差度Bf分別為1.147和0.889，預測值和實測值之間的差異即Af和預測值上下波動的幅度Bf均在15%以內，表明該數學模型也能有效預測波動溫度下沙門氏菌的生長動態。

表3 冷卻牛肉在9℃、12℃和波動溫度下沙門氏菌生長預測值的偏差度(Bf)和準確度(Af)Table 3 Bias factor，and accuracy factor of Salmonella at 9℃，12℃ and fluctuating temperature

圖4 波動溫度下冷卻牛肉中沙門氏菌的實測值與預測值曲線Fig.4 Predicted and observed curves of TPC grown on chilled beef during fluctuated temperatures

3 討論

影響沙門氏菌生長的主要因素是外在的溫度變化，因此本文主要研究溫度的變化對該菌生長的影響。并且冷卻肉主要是在冷鏈狀態進行運輸和銷售，在20℃以上產品的流通期很短［23］，因此本實驗選取的是實際中可能出現的溫度變化范圍0～20℃，此溫度范圍內建立的沙門氏菌在冷卻牛肉中的生長預測模型具有實際意義。很多關于微生物的預測模型是在液體培養基中進行研究［24-26］，因為在培養基上比在真實食品上更容易控制不同的影響因子，能在短時間內獲得建模所需的大量實驗數據，但未考慮到不同的肌肉組織對微生物生長給他影響，簡單的液體培養基很難對肉品進行真實的描述，因而預測結果往往要快于實際的生長速度，有時誤差甚至高達40%［27］，而通過向原料食品上接種特定微生物來獲得數據而建立模型，雖然方法繁瑣，但所建模型能有效預測特定微生物在實際食品上的生長。因此，本實驗將沙門氏菌接種到冷卻牛肉表面建立了沙門氏菌的生長動力學模型，并驗證了該模型的可靠性。

國內外很多對于沙門氏菌的生長模型的研究采用的是單一菌種的人工污染［28］，但菌種的種類對沙門氏菌有一定影響［29］。因此采用單一菌種得到的模型，很難做到準確評價肉品中微生物的真實存在狀態。此外，美國農業部食品安全檢驗局建議使用混合菌株或不同血清型的混合菌株進行模擬接種，國外在進行食品體系中生長/失活或抑菌實驗時大多是通過接種混合菌株［30-32］。對此，本實驗選取了4個不同血清型的菌株混合液進行冷卻牛肉接種，以便更好地模擬沙門氏菌實際污染情況。

沙門氏菌的生長動力學模型很多文獻［11-13］已有報道，多數文獻選用修正的Gompertz模型作為初級模型，并聯用平方根模型來描述不同溫度下沙門氏菌的生長動態。選用修正的Gompertz模型聯用平方根方程可獲得一些重要數據，如最大比生長速率(μmax)、遲滯期(λ)及所需溫度下的函數方程，因此，本實驗選擇修正的Gompertz模型和Linear作為初級模型，Ratkowsy平方根方程作為二級模型。應用修正的Gompertz模型建立了4～20℃不同恒定溫度條件下冷卻牛肉中沙門氏菌生長的動力學模型，相關系數R2均大于0.992，RMSE均小于0.12，表明該方程能很好地描述不同溫度下沙門氏菌在冷卻牛肉中的生長動態;溫度對μ和λ的影響采用平方根模型進行描述，即，其 R2分別為 0.962 和0.942，呈現良好的線性關系，且殘差值在0上下浮動。用9℃和12℃和波動溫度下沙門氏菌生長預測值對模型進行驗證，得出偏差度(Bf)為 0.912、0.991和 0.889，準確度(Af)為1.118、1.019和1.147，說明該模型能有效預測牛肉中沙門氏菌在4～20℃范圍內的生長情況。

綜上所述，本研究所建立的沙門氏菌生長動力學模型可以快速可靠地實時預測沙門氏菌在牛肉中的生長動態，可以為冷卻牛肉中沙門氏菌污染時的預測和監控提供有效的工具，以提高產品的安全性。

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