重組牛凝乳酶原與重組單峰駝凝乳酶原活化速率的初步比較*

普燕，張富春

(新疆生物資源基因工程重點實驗室，新疆大學生命科學與技術學院，新疆烏魯木齊，830046)

凝乳酶最先是以凝乳酶原的形式由胃黏膜細胞分泌，在胃的酸性環境下，酶原活化，從凝乳酶原的N端釋放出42個AA的肽段(propeptide)，形成有活性的凝乳酶［1］。凝乳酶從進化上來源于胃蛋白酶家族，不同種屬動物凝乳酶基因與蛋白的序列相似度極高［2］，將genbank獲得的單峰駝凝乳酶與牛凝乳酶編碼序列進行比對，其核酸與氨基酸的相似度分別為87.87% 和83.73%，比對兩種酶原的propeptide氨基酸序列，相似度為76.2%。有研究報道，牛凝乳酶與單峰駝凝乳酶的晶體結構也極為相似［3］，但是二者對牛乳κ-酪蛋白的凝乳活力、非特異蛋白水解活力、對底物的催化效率卻有顯著差別。Kappeler等［4］克隆表達的單峰駝重組凝乳酶顯示其凝乳酶活性比牛凝乳酶高70%，而非特異水解活性卻只有其20%。這些研究結果也顯示兩種酶一級結構和三級結構的相似性不能掩蓋其分子水平的差異，而這些分子水平的細微差異有時卻顯出其獨特性。

關于重組牛凝乳酶的原核表達研究已經有20多年的歷史，1990年即被美國食品與藥品管理局批準成為第一個安全并可運用于食品的重組酶［5］。實驗依照重組牛凝乳酶的表達與復性方法，獲得了重組單峰駝凝乳酶原，對其進行酸化/中和處理以獲得成熟單峰駝凝乳酶時，發現兩者活化速率有顯著差別，牛凝乳酶原活化速率較單峰駝凝乳酶原高很多，用牛凝乳酶原N端序列代替單峰駝凝乳酶原相應序列，融合蛋白并沒有表現出更高的活化速率，本文對此進行了研究與探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質粒

大腸桿菌 E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、表達載體 pET30a、pET30a-c-proCHY、pET30a-b-proCHY、pGEX-4T-1-proCHY-BC為本實驗室保存;突變載體pET30a-MUT-1和pET30a-MUT-2由武漢轉導生物科技發展有限公司構建;所有重組表達質粒送上海生工公司測序以保證序列正確。

1.1.2 試劑

蛋白Marker購于北京康為世紀生物科技有限公司和大連寶生物工程有限公司，其他試劑為國產分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組蛋白大量表達與包涵體復性［6］

誘導表達1 L菌液，8 000 r/min離心1 min后除去培養基上清，菌體沉淀用20 mL PBS洗滌3次，加18 mL 細胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L EDTA，pH 8.0)，2 mL 10%Triton X-100，加苯甲基磺酰氟(PMSF)至終濃度為1 mmol/L及添加溶菌酶至終濃度1 mg/mL，冰浴30 min，超聲至菌液不再黏稠。12 000 r/min離心20 min，棄去上清，沉淀加20 mL細胞裂解液和2 mL 2%脫氧膽酸，冰浴30 min，期間不斷攪拌。12 000 r/min離心15 min，棄去上清，重復洗滌3次。加6 mol/L尿素溶解包涵體，12 000 r/min離心去除不溶雜質，將溶液裝入透析袋中，放入約50倍體積的 TE透析液(20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)中透析，每12 h換一次尿素含量從高向低逐級遞減的透析液，最后用不含尿素的透析液透析3次，12 000 r/min離心20 min，將上清液分裝保存。

1.2.2 酶原活化(即酸化/中和處理)

將獲得的重組凝乳酶原或融合蛋白用1 mol/L HCl調pH到2.0(或根據實驗需要調至不同的pH)，室溫放置2 h(或根據實驗需要放置不同的時間)，再用1.5 mol/L Tris回調pH到6.0，制樣，進行SDS-PAGE電泳。

1.2.3 牛凝乳酶原不同活化時間檢測

將重組牛凝乳酶原(N端融合GST標簽)用1 mol/L HCl調pH到2.0并開始計時，分別在活化5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、90 min、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h 和4 h取樣，迅速置于沸水中制樣，用SDS-PAGE電泳檢測酶原的活化情況。

1.2.4 單峰駝凝乳酶原不同活化時間檢測

圖1 兩種融合蛋白的序列設計簡圖Fig.1 The sequence of the two fusion proteins(The different AA were showed in bold and the autocatalytic site was showed with the arrow)

將重組單峰駝凝乳酶原用1 mol/L HCl調pH到2.0 并開始計時，分別在活化 2 h、3 h、4 h、5 h、17 h和3 d時取樣，迅速置于沸水中制樣，用SDS-PAGE電泳檢測酶原的活化情況。

1.2.5 驗證PBS和PB中能夠加速單峰駝凝乳酶原活化的離子試驗

稱取 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4和0.24 g KH2PO4，分別將這4種試劑溶于100 mL滅菌去離子水中，4℃保存。進行離子驗證試驗時，將這4種溶液分別以1∶10的比例加入到TE透析復性的單峰駝凝乳酶原中，調pH到2.0，室溫放置2 h，再將pH回調至6.0，取樣進行SDS-PAGE電泳檢測分析。

1.2.6 融合蛋白表達載體的序列設計

用牛凝乳酶原propeptide序列部分或全部(見圖1中下劃線序列)代替單峰駝凝乳酶原的相應propeptide序列，融合后的序列見圖1所示:融合蛋白MUT-1是將牛凝乳酶原的剪切位點附近的一段氨基酸序列(包括propeptide C端的41和42位氨基酸以及成熟肽N端的1-6位氨基酸)替換了單峰駝凝乳酶原相同位置的氨基酸殘基;融合蛋白MUT-2是將單峰駝凝乳酶原N端的一段序列完全替換成牛凝乳酶原氨基酸序列(包括propeptide全長以及成熟肽N端的1-6位氨基酸)。

2 結果

2.1 重組單峰駝凝乳酶原與牛凝乳酶原在相同條件下活化速率比較

2.1.1 兩種凝乳酶原酸化/中和處理2 h結果

取適量TE透析復性的單峰駝凝乳酶原和牛凝乳酶原，按照方法1.2.2活化2 h，分別制樣進行SDS-PAGE電泳檢測，發現牛凝乳酶原在2 h之內全部自剪切形成凝乳酶(圖2B)，而單峰駝凝乳酶原在2 h內只產生非常少量的凝乳酶(圖2A)。

2.1.2 牛凝乳酶原不同活化時間檢測

圖2 凝乳酶原活化2 h的結果Fig.2 The activation of the two prochymosins within 2 hours

根據上述結果，牛凝乳酶原在活化2 h之內能全部發生自剪切形成凝乳酶，為探究該過程中酶原的剪切與凝乳酶的產生趨勢，我們進行了凝乳酶原活化不同時間的檢測，發現酶原在活化5 min之內就迅速發生自剪切，大部分酶原被切割形成凝乳酶和GST-propeptide(見圖3中箭頭所示)，2 h內酶原能全部水解。

2.1.3 單峰駝凝乳酶原不同活化時間檢測

從2.1.1結果來看，單峰駝凝乳酶原活化2 h獲得的凝乳酶量很少，延長活化時間后，我們發現在pH2.0的酸性條件下，單峰駝凝乳酶原較緩慢地發生自剪切，到17 h時，酶原才切割了一半，在活化3 d時，凝乳酶原基本自剪切完。但在強酸環境下，也導致蛋白的降解(見圖4最右邊的泳道)。

2.1.4 比較TE和PBS、PB透析單峰駝凝乳酶原的活化速率

根據2.1.1和2.1.3結果來看，原核表達并復性獲得的單峰駝凝乳酶原保留有完全的自剪切功能，只是自剪切的速率較牛凝乳酶原低很多。對于凝乳酶自身來說，長時間的強酸環境會導致蛋白降解(見圖4最后一條泳道)。同時，較慢的活化速率對今后的工業化生產不利，會占用更多設備，增加成本。是否存在某些離子能加速酶原的自剪切，我們考慮到更換蛋白透析液來改變酶原溶液中的離子。常用的蛋白透析液除了上述的TE之外，還有PBS、PB、TBS等緩沖液，選擇實驗室常用的PBS和PB對6 mol/L尿素溶解的單峰駝凝乳酶原包涵體進行透析。透析完成后比較TE與PBS、PB透析單峰駝凝乳酶原的活化速率，見圖5，明顯發現PBS和PB透析的單峰駝凝乳酶原比TE透析的酶原活化速率高，從未剪切的凝乳酶原量來比較，我們可以看出PBS和PS透析酶原在2 h時發生剪切的酶原量相當于TE透析蛋白8 h剪切的酶原量。

圖3 融合GST標簽的牛凝乳酶原不同活化時間的檢測Fig.3 The activation of the bovine prochymosin with GST tag by different time

圖4 單峰駝凝乳酶原不同活化時間的檢測Fig.4 The activation of the camel prochymosin by different time

2.1.5 PBS和PB中的Na+能夠加速單峰駝凝乳酶原的活化

PBS和PB兩種緩沖液均能加速單峰駝凝乳酶原的活化，為探究哪種離子最終起到了作用，我們將這兩種緩沖液中包含的4種離子分別以透析時的濃度加入到TE透析復性的單峰駝凝乳酶原中，調pH到2.0，室溫放置2 h，取樣進行 SDS-PAGE檢測分析。結果顯示，加速酶原活化的是Na+。如圖6所示，加入Na+的酶原活化速率明顯比加入其他離子的酶原活化速率高，比較未加任何離子的酶原活化速率，加入其他離子幾乎沒有提高酶原的活化速率。

圖5 TE、PBS、PB透析單峰駝凝乳酶原的活化速率比較Fig.5 The activation rate comparison of the different camel prochymosins which dialysed by TE，PBS and PB

2.2 單峰駝凝乳酶原序列與牛凝乳酶原序列融合蛋白的表達與檢測

圖6 TE透析單峰駝凝乳酶原中加入不同離子的活化速率檢測Fig.6 The activation rate comparison of the camel prochymosins(TE dialysis)by adding different ions

使用相同的表達條件和酸化/中和步驟，獲得的重組牛凝乳酶原和單峰駝凝乳酶原活化速率差別顯著，這是否與牛凝乳酶原和單峰駝凝乳酶原的自剪切位點及propeptide序列有關，將牛凝乳酶原自剪切位點附近的氨基酸序列和propeptide序列替換單峰駝凝乳酶原相應序列，構建了兩個融合蛋白，并進行了融合蛋白的原核表達純化與自剪切功能的檢測。

2.2.1 融合蛋白表達載體的設計與構建

用DNAMAN軟件將牛凝乳酶原和單峰駝凝乳酶原氨基酸序列進行比對，見圖7，發現二者propeptide序列中有10個氨基酸不同，牛propeptide序列比單峰駝propeptide少一個堿性氨基酸。比對結果還可以看出在自剪切位點附近，二者氨基酸序列差異很大，尤其是氨基酸的帶電荷情況差異明顯。是否因為這些氨基酸殘基的不同而導致兩種酶原活化速率的懸殊，我們設計了兩個融合蛋白，即用活化速率高的牛凝乳酶原propeptide序列部分或全部代替單峰駝凝乳酶原的propeptide(序列設計見方法1.2.6)，一方面驗證propeptide的序列能否決定酶原的活化速率，另一方面也期望獲得較高活化速率的融合單峰駝凝乳酶原。

圖7 牛凝乳酶原與單峰駝凝乳酶原propeptide序列比對(框中顯示兩種酶原的propeptide序列，箭頭指示酶原自剪切位點)Fig.7 The sequence alignment between the bovine and camel propeptide(the propeptide sequences were framed and the autocatalytic site was showed with the arrow)

2.2.2 融合蛋白大量表達與活化情況的檢測

將兩個融合蛋白核酸序列構建到pET30a原核表達載體上，經測序確定序列正確后進行大量表達與純化，獲得MUT-1和MUT-2兩個融合蛋白。

用HCl調酶液pH到2.0，分別在不同時間(10 min、20 min、30 min、1h、2h、4h)取樣，進行 SDS-PAGE電泳檢測，發現融合蛋白MUT-1無論活化時間長短，均不能進行剪切，而MUT-2表現出類似于單峰駝凝乳酶原的活化速率(見圖8)。

將融合蛋白MUT-1在不同的pH(1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)條件下進行活化處理，發現MUT-1均不能發生剪切(見圖9)。

在MUT-2酶液中加入終濃度為0.9 g/L NaCl，SDS-PAGE電泳檢測活化1～6 h的情況，發現其自剪切情況與單峰駝凝乳酶極其相似(見圖10)，Na+能大大提高酶原的活化速率。

圖8 檢測MUT-1和MUT-2在pH 2.0條件下不同時間的活化情況Fig.8 The activation of the MUT-1 and MUT-2 in pH2.0 by different time

3 討論

圖9 檢測MUT-1在不同的pH條件下的活化情況Fig.9 The activation of the MUT-1 in different pH values

圖10 加入0.9 g/L NaCl的MUT-2活化情況Fig.10 The activation of the MUT-2 by adding 0.9g/L NaCl

單峰駝凝乳酶于2006年被克隆表達及酶學特性鑒定，發現其c/p值優于牛凝乳酶［4］，2009年報道其制備的干酪擁有更好的質地與風味，比小牛凝乳酶更適合制作cheddar干酪［7］后，同年黑曲霉發酵生產的重組單峰駝凝乳酶上市出售，同時，駱駝凝乳酶的基因與蛋白序列［8］以及用駱駝凝乳酶制備干酪［9］等均被申請國際專利。由于駱駝凝乳酶具有比牛凝乳酶更高的催化活性，目前很多研究圍繞駱駝凝乳酶展開，如檢測其對牛乳中 κ-酪蛋白［10］以及 αs1-、β-酪蛋白［11］的水解肽譜，凝乳酶與底物的結合等［3，12-14］，其已然成為凝乳酶催化的分子機理研究和如何對凝乳酶進行點突變以提高凝乳活力的研究材料。Jensen等人［3］對黑曲霉表達的重組單峰駝凝乳酶進行了分離和鑒定，他們分離出了6種不同的酶類型(variant)，其中有4種酶類型被黑曲霉進行了糖基化，兩種沒有被糖基化，并且發現沒有被糖基化的酶活力比糖基化的酶高。本實驗利用大腸桿菌成功表達重組駱駝凝乳酶原并獲得有活性的重組駱駝凝乳酶，而大腸桿菌不具有蛋白翻譯后加工的特性，故不會對重組駱駝凝乳酶進行糖基化，由此我們認為大腸桿菌表達純化獲得的重組駱駝凝乳酶將會有更優的凝乳活力。

在哺乳動物體內，凝乳酶原活化發生在胃酸環境中。體外實驗得出結論，當pH低于5.0時，凝乳酶原發生活化，剪切特定位點的肽鍵，釋放N端的42個AA(propeptide)，形成有活性的凝乳酶［15］。凝乳酶屬于天冬氨酸蛋白酶家族，該家族已有的晶體結構顯示出各個成員結構極其相似，均包含很多β折疊，形成兩個類似對稱的結構域，中間是底物結合區［15］。目前只報道了牛凝乳酶的晶體結構，沒有牛和駱駝凝乳酶原的晶體結構，我們用已報道的豬胃蛋白酶原A的晶體結構進行酶原結構的描述。酶原中propeptide形成3個短α螺旋，在N端形成一個β折疊，該β折疊剛好位于酶的活性中心，覆蓋了底物結合位點，防止底物進入酶活中心，同時讓酶在中性條件下保持無活性狀態。當在酸性環境下，propeptide與酶的靜電結合作用被破壞，從而引起構象改變，propeptide被切割后釋放，propeptide與酶活性中心解離后，酶的活性位點暴露，從而對底物具有催化活性［16-17］。

關于酶原的激活，以牛凝乳酶原為例，其propeptide有兩個切割位點，當pH為4～5時，酶原自剪切去除N端1-42 AA肽段，形成有活性的凝乳酶;當pH為2.0時，酶原自剪切去除N端1-27 AA肽段，形成假凝乳酶。假凝乳酶在pH低于3和pH高于6時相對穩定，但在pH 5.5時，會繼續加工形成凝乳酶。同時，假凝乳酶和凝乳酶都具有相同的活性［18］。目前，關于牛凝乳酶原常用的活化方法是，將酶原pH調至2.0，室溫放置2h，再回調pH到6.0，后續進行凝乳酶的純化。單峰駝凝乳酶原的原核表達目前還沒有見報道，kappeler等［4］表達的重組單峰駝凝乳酶是在黑曲霉宿主中表達的，該文中沒有提到單峰駝凝乳酶原的活化，有可能在發酵過程中酶原發生自動剪切直接產生成熟的單峰駝凝乳酶，Vallejo等用真核表達系統表達牛凝乳酶原或水牛凝乳酶原，同樣是直接表達出凝乳酶而不是酶原［19-21］。本實驗原核表達的重組單峰駝凝乳酶原是通過包涵體溶解復性獲得的，采用牛凝乳酶原活化常用方法對其進行活化，發現其活化效率比牛凝乳酶原低很多。牛凝乳酶原在pH 2.0條件下，2 h內完全活化，而單峰駝凝乳酶原需要3 d以上，這種差異可能是由于兩者propeptide序列不同造成的。不同酶原由于一級氨基酸序列不同，其propeptide與酶活性位點的靜電結合作用強弱不同，從而導致酶原的活化速率不同。如人胃蛋白酶原的兩種同工酶原A-3、A-5，序列上只有1個氨基酸的區別，前者43位是Glu，而后者是Lys，與此同時，A-5的活化速率比A-3低，理論上推測是由于A-5多了1個帶正電荷的氨基酸，故與酶活位點靜電荷作用增強之故［15］。對駱駝凝乳酶原和牛凝乳酶原進行propeptide序列比對，其相似度為76.2%，有10個氨基酸殘基不同，且單峰駝凝乳酶原的propeptide序列比牛凝乳酶原多一個堿性氨基酸。在自剪切位點附近，兩個序列因為氨基酸的差別而導致極性與所帶電荷差別很大(見圖7)。是否因為propeptide的這些差異導致2種重組酶原活化速率的差異，本試驗做了2種突變。

將牛凝乳酶原自剪切位點附近序列和牛凝乳酶原的N端序列分別代替單峰駝凝乳酶原中的相應序列，構建2個融合蛋白MUT-1和MUT-2(具體方法見1.2.6)，以期獲得具有牛凝乳酶原高活化速率的融合單峰駝凝乳酶原，這樣該酶原進行工業化發酵生產時，能縮短生產周期，節約成本。

將這2個融合蛋白通過相同表達體系大量表達并復性后，經活化處理檢測其活化速率，發現融合蛋白MUT-1在任何pH條件均不能獲得有活性的單峰駝凝乳酶。這可能由于替換的序列位于自剪切位點附近，該序列不能被酶識別并剪切，或是對propeptide與酶的結構有一定影響，不能發生構象改變及切割。融合蛋白MUT-2的活化速率以及添加NaCl能提高活化速率的實驗結果與單峰駝凝乳酶原自身活化情況很相似。這也提示酶原的剪切不僅僅涉及propeptide序列和自剪切位點，成熟酶的結構、酶活以及其與propeptide的相互作用等都可能對酶原的活化有影響。

Ka?par等［23］在牛凝乳酶原的N端第5個殘基前插入了不同長度的SV40病毒的小t抗原序列，包括小t抗原 N 端93、63、47、12和1個 AA，構建出幾個融合酶原。經檢測，只有融合47和12個AA的酶原產生穩定的蛋白產物并且只有后者能活化產生凝乳酶，融合93和63個AA的酶原都不穩定而被降解。這說明，在酶原的N端融合不同長度的肽對酶原的正確折疊有影響。我們實驗中表達載體使用的是pET30a，該表達載體會在外源蛋白前融合一個6 His標簽，同時標簽與酶原中還存在一段連接序列，共50個AA，這些 AA都位于酶原的 N端，也許會對propeptide序列的三級結構形成有一定影響，或是空間位阻不利于酶對自剪切位點的催化。當然，關于相同標簽位于牛凝乳酶原的N端為何沒有對牛凝乳酶原的活化產生影響，推測這些差異可能還是源自兩種酶原分子水平氨基酸序列的不同，如組成凝乳酶的氨基酸所帶電荷不同，propeptide與酶活性中心的靜電作用強度不同等，還需深入研究。

Justesen等［24］將牛凝乳酶原的propeptide部分序列插到標簽和異源蛋白之間，目的是通過標簽方便純化目的蛋白，然后再通過凝乳酶對目的蛋白進行切割，最終得到不帶任何標簽的天然目的蛋白。Justesen等人只選取了牛凝乳酶propeptide C端的15氨基酸(理論 pI值低于7，而全長 propeptide pI值接近10)作為凝乳酶的識別位點連接到目的蛋白N端，結果融合蛋白在溫和的條件下(pH6.2)就可以被凝乳酶識別并切割去除標簽。利用網站(http://web.expasy.org/compute_pi/)分析牛凝乳酶原和單峰駝凝乳酶原的propeptide的pI值，分別為9.7和10.37，若計算N端的his標簽和連接序列(共50個AA)，二者pI值分別為6.70和8.12，的確牛凝乳酶的序列所帶電荷更少。縮短重組凝乳酶原的propeptide序列可以降低propeptide與酶活性位點的靜電作用，能在偏中性的pH條件下被切割。酶原propeptide與成熟酶之間是靜電結合作用，減少其之間的靜電作用可以提高酶原的活化速率，這可能是因為較弱的靜電作用使propeptide與成熟酶結合較松，這樣更容易進行活化所必需的構象轉變［15］。下一步將對單峰駝凝乳酶原的propeptide序列進行氨基酸點突變，減少帶正電荷的數量，或是縮短propeptide序列，以期提高酶原的活化速率，為該酶的工業化生產提供技術支持。

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