紅曲霉酒曲的制備*

林秋，馬瑩瑩，楊建剛，林艷，吳赫川，竇曉

(四川理工學院生物工程學院，四川 自貢，643000)

紅曲霉(Monascus)的用途很多，我國早在明朝就用它來制作紅曲，作為藥用和釀制紅色的酒或醋［1］，近代紅曲霉被廣泛應用于食品著色、釀酒、防腐以及醫(yī)藥領(lǐng)域［2-3］。目前，因紅曲霉能夠產(chǎn)活性較強的酯化酶［4］，且在適當?shù)臈l件下，該酯化酶可直接催化己酸與乙醇合成己酸乙酯，并使反應速度大大加快，從而可縮短白酒的生產(chǎn)周期和提高優(yōu)質(zhì)品率［5-7］，因此在釀酒領(lǐng)域得到了極大的關(guān)注及應用。紅曲霉嗜酸，特別是乳酸，能以乳酸為碳源，生長繁殖并產(chǎn)酯化酶，故在濃香型白酒的生產(chǎn)中起到了降低酒體中乳酸及乳酸乙酯的作用，同時產(chǎn)生的酯化酶促使己酸與乙醇生成己酸乙酯，從而起到增加己酸乙酯降低乳酸乙酯含量的作用［8］，對發(fā)酵后白酒的風味和品質(zhì)非常有利［9-10］。有研究發(fā)現(xiàn)，在強化大曲的生產(chǎn)中加0.5%的紅曲霉進行制曲，酯化力比原工藝提高3.8 mg/g，提高了16.8%［11］。然而在實際的制曲過程中，由于紅曲霉的繁殖力相對較弱，生長較其他霉菌緩慢，非常難培養(yǎng)［12-13］，在大曲菌系中沒有競爭優(yōu)勢，難以形成優(yōu)勢菌種。所以，利用純培養(yǎng)技術(shù)并對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，擴大培養(yǎng)，使紅曲霉在制曲過程中保持生長優(yōu)勢，預期可獲得較好的效果。

本研究以秈米為原料，接種以麩皮制備的純種紅曲霉種曲，以酯化力為指標，通過單因素試驗確定其較優(yōu)水平所在的范圍，再結(jié)合BBD響應面實驗對主要影響純種紅曲霉曲酯化力的因子進行優(yōu)化，以求得到一種酯化力較高，且質(zhì)量穩(wěn)定的純種紅曲霉曲。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

酯化紅曲霉，浙江工業(yè)大學提供。

1.1.2 菌懸液的制備

取培養(yǎng)好的紅曲霉斜面試管1支，以無菌操作的方式，加入10 mL無菌生理鹽水，用接種環(huán)將斜面上的孢子輕輕刮下，充分振蕩，制成合適濃度的孢子懸液，接種時，以孢子懸液的形式進行接種。

1.1.3 種曲的制備［14］

在250 mL三角瓶中裝入10 g麩皮(含水量60%)，搖勻后，在121℃高壓蒸汽滅菌20 min，放入無菌接種箱中，冷卻到30℃時，添加0.2%/瓶的乳酸，接種0.1 mL/瓶的紅曲霉斜面試管菌懸液，放入35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。

1.1.4 原輔料

秈米，市售，含水量 12.5%;釀造水，符合GB5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標準》。

1.2 工藝流程

秈米→洗米→浸泡24 h→瀝水→蒸米→降溫→接種→恒溫培養(yǎng)→扣瓶→出曲

1.3 操作要點

洗米:除去附在米粒表面的雜質(zhì)，如糠、塵土及夾雜物等。

浸米:由于秈米的吸水性較差，故需浸泡較長時間，20℃下需浸泡12 h以上。當米粒從外觀上看透明感消失，變成純白色，用手能將米粒碾碎時，即可撈出，瀝水0.5 h后，分裝蒸米。

蒸米:用高壓蒸汽滅菌鍋，110℃，45 min。蒸出的秈米熟而不爛，內(nèi)無白心生米。

接種:接種前將接種箱清理干凈，并用75%的乙醇將實驗器具消毒，再將蒸熟后的米置于接種箱內(nèi)降溫，開啟紫外燈滅菌2 h后，再接種1.1.3中的種曲。

恒溫培養(yǎng):培養(yǎng)之前12 h，開啟紫外燈滅菌，然后調(diào)節(jié)溫度到試驗溫度，再將接種好的三角瓶放入恒溫培養(yǎng)。

扣瓶:由于菌絲的生長會造成米粒結(jié)塊，也不利于氧氣的供應，使紅曲的質(zhì)量下降。因此應及時扣瓶，將結(jié)塊的米粒打散。本試驗的扣瓶頻率為每12 h 1次。

1.4 酯化液的制備［15］

取100 mL 1%己酸乙醇溶液于250 mL蒸餾燒瓶中，加入相當于5 g干曲的曲量，在30～32℃保溫酯化100 h。然后加水50 mL，加熱蒸餾，接收蒸出液100 mL，測定餾出液中己酸乙酯含量。

1.5 酯化力的測定［15］

吸取50 mL餾出液，用0.1 mol/L NaOH中和到酚酞終點。準確加入0.1 mol/L NaOH 25 mL，沸水浴中回流皂化30 min。冷卻后用0.05 mol/L H2SO4滴定到酚酞粉色消失為終點。

式中:c1，c2分別為NaOH和H2SO4的濃度，mol/L;V1，V2分別為NaOH和H2SO4標準溶液的體積，mL;m，干曲質(zhì)量，g;為從蒸出液100 mL中取50 mL測酯;144為己酸乙酯的換算系數(shù)。

1.6 單因素實驗設(shè)計

影響紅曲霉產(chǎn)酶條件的主要因子及研究范圍見表1。在分別做每個單因素時，其他因子固定為:接種量0.3%，培養(yǎng)時間8 d，乳酸添加量0.2%，培養(yǎng)溫度33℃。

1.7 響應面實驗設(shè)計

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以酯化力為指標，以接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間為自變量，應用BBD響應面實驗法對制備純種紅曲霉曲的工藝條件進行優(yōu)化。各因素的實驗水平范圍見表2。

表1 試驗因素水平表Table 1 Levels of single factor experiment

表2 因素水平表Table 2 Levels of response surface methodology experiment

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 接種量對紅曲霉曲酯化力的影響

由圖1可知，接種量在0.1%～0.5%的范圍內(nèi)變化時，酯化力先上升后下降。當接種量為0.4%時，酯化力最高，隨著接種量的繼續(xù)增大，酯化力開始逐漸降低。一般而言，接種量越大微生物的生長越快，但是當接種量過大時，微生物個體間會形成營養(yǎng)競爭，這對菌體的生長將產(chǎn)生不利影響。在響應面實驗中選擇接種量為0.3%～0.5%。

圖1 接種量對紅曲霉曲酯化力的影響Fig.1 Effects of inoculation on Monascus koji capacity of esterification

2.1.2 乳酸添加量對紅曲霉曲酯化力的影響

由圖2可知，乳酸添加量在0.0～0.4%的范圍內(nèi)變化時，酯化力先緩慢上升后快速下降。當乳酸添加量為0.1%時，酯化力最高。紅曲霉是一種嗜酸菌［16］，一定乳酸的添加有利于紅曲霉的生長，添加過多的乳酸也會影響紅曲霉生長及產(chǎn)酶。鑒于該實驗中乳酸的添加量已經(jīng)很少，且乳酸添加超過0.1%后，不利于紅曲霉產(chǎn)酯化酶，故在響應面實驗中不再對其進行優(yōu)化，選擇乳酸添加量為0.1%。

圖2 乳酸添加量對紅曲霉曲酯化力的影響Fig.2 Effects of lactic acid amount on Monascus koji capacityof esterification

2.1.3 培養(yǎng)時間對紅曲霉曲酯化力的影響

由圖3可知，當培養(yǎng)時間在6～10 d時，酯化力隨著培養(yǎng)時間的增加先增加后繼續(xù)緩慢增加，第7天時酯化力的增加趨于平緩，隨著培養(yǎng)時間的繼續(xù)延長，酯化力增加較少，第10天略微減少?；跁r間及酯化力后續(xù)增加較少，故選擇6、7、8 d的培養(yǎng)時間。

圖3 培養(yǎng)時間對紅曲霉曲酯化力的影響Fig.3 Effects of cultivation time on Monascus koji capacity of esterification

2.1.3 培養(yǎng)溫度對紅曲霉曲酯化力的影響

圖4 培養(yǎng)溫度對紅曲霉曲酯化力的影響Fig.4 Effects of cultivation temperature on Monascua capacity of esterification

由圖4可知，隨著溫度的升高，紅曲霉酯化力呈現(xiàn)出先升高后降低的變化規(guī)律，在31～35℃時，糖化酶活力較高。當溫度大于35℃時，酯化力開始逐漸降低。可能是因為在溫度較低時，紅曲霉的生長不旺盛，產(chǎn)酶量較低，而溫度過高時同樣也會對紅曲霉的生長產(chǎn)生抑制，使曲的酯化力下降。因此在響應面設(shè)計時，選用31、33、35℃的培養(yǎng)溫度。

2.2 響應面實驗

為了研究不同因素對紅曲霉曲酯化力的影響，確定其最佳工藝條件，本研究選擇對紅曲酶曲酯化力影響較大的3個因素(接種量、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度)做響應面回歸分析，實驗結(jié)果見表3。

表3 響應面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Results and the experiment design of response surface methodology

利用Design-Expect軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，最后得到的回歸方程為:Y=106.26-0.72A-1.79B-0.58C-0.36A B-2.38 A C-5.35B C-1.45A2-6.53B2-7.68 C2，R2=0.987 6。對回歸方程進行方差分析，其結(jié)果見表4。

從表4可以看出，此模型的P=0.0003＜0.01，說明該響應面回歸模型達到極顯著水平。其決定系數(shù)R2=0.9876，表明模型中98.76%的數(shù)據(jù)可用這個模型解釋。本試驗所建模型中B、AC、BC、B2、C2對酯化力的影響顯著(P＜0.05)，失擬項數(shù)據(jù)分析表明該模型失擬不顯著，因此該二次模型能夠較好地擬合真實的響應面數(shù)據(jù)。

2.3 模型分析討論

利用Design-Expect8.0.6軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理，得到響應曲面(RSM)的三維圖(見圖5～圖7)，其綜合反映了各變量與響應值之間、變量與變量之間的關(guān)系。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 regression analysis of variance

2.3.1 接種量和培養(yǎng)溫度的交互作用

由圖5可知，響應曲面的坡度較為陡峭，表明響應值(酯化力)對接種量和培養(yǎng)溫度的改變較為敏感。當接種量不變時，隨著培養(yǎng)溫度的增加，酯化力先升高再下降;當培養(yǎng)時間保持恒定時，隨著接種量的增加，酯化力變化不明顯，當接種量在0.32%～0.43%之間、培養(yǎng)溫度在32.2～33.27℃之間時對提高酯化力最為有利。從等高線圖可以看出兩個因素的交互作用較弱，對酯化力的影響不顯著。

圖5 酯化力與接種量和培養(yǎng)溫度關(guān)系的響應面圖和等高線圖Fig.5 Response surface plot and contour plot of the effects of inoculation quantity and cultivation temperature on capacity of esterification

2.3.2 接種量和培養(yǎng)時間的交互作用

由圖6可知，響應曲面的坡度較為陡峭，表明響應值(酯化力)對接種量和培養(yǎng)時間的改變較為敏感。當接種量不變時，酯化力隨著培養(yǎng)時間增加先增大后減小，當培養(yǎng)時間保持不變時，酯化力隨著接種量的增加略微增大。當接種量在0.32%～0.43%，培養(yǎng)6.77～7.23 d時對提高酯化力最有利。從等高線圖可以看出兩個因素的交互作用強，對酯化力的影響極顯著。

2.3.3 培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間的交互作用

由圖7可知，響應曲面的坡度陡峭，表明響應值(酯化力)對培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間的改變敏感。當培養(yǎng)時間保持不變時，隨著培養(yǎng)溫度的升高，酯化力先快速升高再緩慢下降;當培養(yǎng)溫度保持恒定時，隨著培養(yǎng)時間的延長，酯化力先增加后減少，當溫度在31.72.6～33.71℃之間、培養(yǎng)時間在6.55～7.47d之間時對提高酯化力最為有利。從等高線圖可以看出兩個因素的交互作用強，對酯化力的影響極顯著。

圖6 酯化力與接種量和培養(yǎng)時間關(guān)系的響應面圖和等高線圖Fig.6 Response surface plot and contour plot of the effects of inoculation quantity and cultivation time on capacity of esterification

3 結(jié)論

圖7 酯化力與培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間關(guān)系的響應面圖和等高線圖Fig.7 Response surface plot and contour plot of the effects of cultivation temperature and time on capacity of esterification

通過BBD響應面設(shè)計試驗對影響紅曲酯化力的3個主要因素(接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間)及制曲的最佳工藝條件進行了研究，在以上實驗結(jié)果分析及模型擬合的基礎(chǔ)上，利用“Design-Expert”軟件中的Optimization功能對制曲工藝進行優(yōu)化，結(jié)果顯示3個因素對紅曲酯化力的影響是顯著的。利用統(tǒng)計學方法建立了紅曲酯化力與3個因素間的2次回歸模型，其回歸方程為:Y=106.26-0.72A-1.79B-0.58C-0.36A B-2.38 A C-5.35B C-1.45A2-6.53B2-7.68 C2，決定系數(shù)R2=0.982 7。優(yōu)化出的最佳預測工藝條件為:接種量為0.37%，培養(yǎng)溫度32.69℃，培養(yǎng)時間7.06 d。在此條件下紅曲霉曲酯化力的預測值為108.64 mg/g，對試驗優(yōu)方案進行驗證，得到紅曲霉曲的酯化力為(107.85±0.51)mg/g，實際值與預測值基本一致，表明預測值和真實值之間擬合較好，驗證了模型的可靠性。

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