鼠李糖乳桿菌乳飲料發酵工藝*

張明，代青梅，任發政，楊子彪，趙亮

1(北京工商大學食品學院，北京，100048)

2(中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京，100083)

3(大理農林職業技術學院食品工程與經管系，云南大理，671003)1

鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnose)是國家認可的第3代益生菌的一種，可以黏附于腸道上皮細胞并定殖于人體［1-5］，可提高人體免疫能力［6-7］，緩解腸道疾病［8-9］，消減體內毒素［10］;抑制，殺死有害菌等生理功能［11］。然而，目前市場上的鼠李糖乳桿菌產品多數為直接將益生菌直接添加，在產品生產過程中鼠李糖乳桿菌沒有增殖，成本高。本文對鼠李糖乳桿菌的發酵條件和工藝進行了優化，以便進一步研究大規模發酵生產工藝，為菌株的廣泛應用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

鼠李糖乳桿菌 (Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103)，維利奧公司提供。

MRS培養基:蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，葡萄糖 20 g，CH3COONa 5 g，K2HPO42 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·4H2O 0.2 g，半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g，吐溫80 1 mL，蒸餾水1 000 mL，調 pH 至6.2～6.4。

1.2 儀器

Delta-320型 pH計，瑞士 Mettler Toledo公司;DHG-9240A型熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司;MIR-162型電熱恒溫培養箱，日本三洋公司;APV1000高壓均質機，德國APV公司;HVA-110型滅菌器，日本Hirayama公司;VIS-7220型分光光度計，北分瑞利分析儀器有限責任公司;3K3O高速離心機，德國Sartorius公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 發酵乳飲料基本工藝流程

發酵劑制備:配制并殺菌MRS液體培養基接種鼠李糖乳桿菌，37℃培養活化1～3次，在菌體對數生長末期收獲菌體，按照2×107CFU/mL分別接種于無菌葡萄糖脫脂乳(脫脂奶粉、葡萄糖和蒸餾水質量比為12∶3∶85)培養基中，37℃培養活化若干次，當凝乳時間達到穩定后完成菌種活化。

發酵乳制作工藝流程:將脫脂奶粉、葡萄糖和蒸餾水以12∶3∶85的質量比混合后，經過預熱、均質、殺菌、冷卻4個步驟后以3%的接種量接種L.rhamnose，經過一定時間發酵破乳后進行第2次均質制得發酵乳。

乳酸菌飲料二次配料工藝流程:按發酵乳與白砂糖溶液(經殺菌的白砂糖溶液，濃度16%)質量比為3∶7混合均勻，定容后進行第3次均質，制成發酵乳飲料成品

1.3.2 檢測指標及檢測方法

沉淀率:在50 mL離心管中準確加入一定量的發酵乳飲料成品，845 g離心10 min，去除上層清液，準確稱取沉淀物的質量(g)，計算沉淀率，作為鼠李糖乳桿菌發酵乳飲料的穩定性的評判指標。

1.3.3 鼠李糖乳桿菌對碳源的利用

將不同碳源(葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖、蔗糖和麥芽糖)以脫脂奶粉、碳源、蒸餾水=12∶3∶85的比例混合后，37 ℃厭氧培養24 h，分別在2，4，8，12，16，20和24 h測定其OD值，測定該菌對各碳源的利用情況并繪制OD值變化曲線。

1.3.4 發酵時間對發酵過程及產品品質的影響

根據2.3.1發酵乳飲料基本工藝流程，12%脫脂乳粉還原乳，添加3%的葡萄糖，105℃，45 min殺菌，冷卻至37℃接種3%，37℃恒溫水浴發酵120 h，從接種開始計時，每24 h取樣測定發酵乳乳酸菌活菌數，同時按照2.3.1發酵乳飲料工藝流程進行乳飲料二次配料并測定其沉淀率。

1.3.5 殺菌條件對發酵過程及產品品質的影響

根據2.3.1發酵乳制作工藝流程，12%脫脂乳粉還原乳，添加3%的葡萄糖，選擇殺菌條件分別為95℃ /60 min，105 ℃/45 min，115 ℃ /15 min殺菌，冷卻至37℃接種3%，37℃恒溫水浴發酵72 h終止發酵并測定發酵乳乳酸菌活菌數，同時按照2.3.1發酵乳飲料工藝流程進行乳飲料二次配料并測定其沉淀率。

1.3.6 發酵溫度對發酵過程及產品品質的影響

根據2.3.1發酵乳制作工藝流程，12%脫脂乳粉還原乳，添加3%的葡萄糖，105℃殺菌45 min，冷卻至35℃，37℃和42℃后，接種3%的鼠李糖乳桿菌，分別在35℃，37℃和42℃恒溫水浴發酵72 h終止發酵并測定發酵乳乳酸菌活菌數，同時按照2.3.1發酵乳飲料工藝流程進行乳飲料二次配料并測定其沉淀率。

1.3.7 發酵工藝的正交試驗

分析發酵時間、殺菌條件、發酵溫度對乳酸菌活菌數、乳飲料的沉淀率的影響和白砂糖濃度對乳飲料的沉淀率的影響結果，對發酵時間，殺菌條件以及發酵溫度進行正交優化試驗。

1.3.8 統計分析方法

首先每個試驗均重復3次，試驗結果利用SPSS分析軟件進行方差分析，采用Duncan，s multiple test方法進行比較分析。a，b，c不同字母表示個處理組之間差異顯著，相同字母則表示無顯著性差異(顯著性水平P=0.05)。

2 結果與討論

2.1 鼠李糖乳桿菌對碳源的選擇

圖1為L.rhamnose在不同碳源的培養基中的生長曲線。可以看出，L.rhamnose在葡萄糖培養基中生長速度最快，發酵24 h后，L.rhamnose在葡萄糖、果糖、半乳糖培養基中的生長沒有顯著差異。L.rhamnose在葡萄糖、果糖、半乳糖為碳源的培養基中生長的速度顯著高于乳糖、蔗糖和麥芽糖，這可能是由于L.rhamnose對單糖的利用效率相對較高，而對多糖的代謝是及其微弱的。出于生產成本的考慮，本研究在后續實驗中選擇發酵快、價格低的葡萄糖作為培養基中的碳源。

圖1 不同碳源對鼠李糖乳桿菌生長的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on the growth of L.rhamnose

2.2 發酵時間對活菌數和產品沉淀率影響

圖2是鼠李糖乳桿菌發酵120 h的過程中，發酵24，48，72，96 和 120 h 時發酵液的 L.rhamnose活菌數和二次配料后乳飲料的沉淀率情況對比結果。

圖2 發酵時間對活菌數及沉淀率的影響Fig.2 Effect of fermentation time on the viable count and precipitation rate

從圖2A可以看出，24～48 h，乳酸菌活菌數呈增長趨勢，48～120 h的發酵過程中乳酸菌活菌數呈降低趨勢，對試驗結果進行方差分析顯示發酵24 h時乳酸菌活菌數顯著低于其他各取樣點乳酸菌活菌數(P＜0.05)，48 h后各取樣點的發酵乳中L.rhamnose活菌數無顯著性差異(P＞0.05)。

從圖2B 可以看出，若以 24，48，72，96和 120 h分別為發酵終點進行二次配料，乳飲料的沉淀率隨發酵時間的延長沉淀率呈降低趨勢。72，96和120 h二次配料的乳飲料沉淀率顯著低于24和48 h(P＜0.05)，72 h，96 h和120 h無顯著性差異(P ＞0.05)，發酵后期沉淀率降低分析原因可能在酸乳發酵后期，乳酸菌釋放出的蛋白酶進一步降解蛋白質生成小肽和氨基酸，降低了沉淀率;另一方面，發酵后期乳酸菌產酸，依靠電荷的排斥力使體系保持分散狀態［12］。

綜合發酵過程中乳酸菌活菌數及乳飲料的沉淀率，選擇發酵72 h時作為發酵終點。72 h終止發酵時即可以得到乳酸菌活菌數大于1×108CFU/mL，沉淀率低乳飲料。

2.3 發酵溫度對活菌數和產品沉淀率影響

圖3為發酵溫度對乳酸菌活菌數和乳飲料沉淀率的結果。從圖3A可以看出，35和37℃發酵對乳酸菌活菌數無顯著性影響(P＞0.05)，二者均顯著高于42℃發酵的L.rhamnose活菌數(P＜0.05);從圖3B可以看出分別在37，42和35℃發酵72 h進行二次配料，乳飲料沉淀率依次升高，差異顯著(P＜0.05)。本試驗中乳酸菌活菌數越高越好，沉淀率越低越好，所以綜合分析，發酵溫度選擇37℃。

2.4 殺菌條件對活菌數及產品沉淀率的影響

由單一鼠李糖乳桿菌發酵生產乳飲料的生長周期較長，在發酵過程中易引起雜菌污染的現象，因此對原料乳進行徹底的殺菌尤其重要，本研究選用了3種不同的殺菌條件，95℃/60 min、105℃/45 min和115℃/15 min，通過比較3種殺菌條件的顏色可知，95℃/60 min殺菌從色澤淺，不可以接受，而105℃/45 min和115℃/15 min殺菌從色澤上可以接受。

圖3 發酵溫度對活菌數和產品沉淀率的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on the viable count and precipitation rate

圖4 殺菌條件對活菌數及產品沉淀率的影響Fig.4 Effect of sterilizing condition on the viable count and precipitation rate

殺菌條件對L.rhamnose活菌數及產品沉淀率的影響如圖4所示。經3種殺菌條件處理的樣品L.rhamnose菌活菌數有顯著性差異，115℃/15 min殺菌處理后，L.rhamnose發酵終點的活菌數顯著高于其他兩種殺菌條件(P＜0.05)。這可能由于乳酸菌對葡萄糖和脫脂乳不同熱處理條件下產物的利用效率不同導致的。而不同殺菌條件下，產品的沉淀率也有明顯的差別，95℃/60 min處理，產品的沉淀率達到8.3%，顯著高于其他兩種殺菌條件(P＜0.05)，105℃/45 min處理后產品的沉淀率也優于115℃/15 min處理。這可能是由于殺菌過程中，熱處理強度不同，乳中成分發生了不同的變化:尤其是加熱過程中可能導致pH下降、美拉德反應褐變反應，以及蛋白質的各種變性以及相互間的反應，加熱處理強度不同，使得乳酸菌對蛋白的降解程度不同，蛋白水解物的數量影響其溶解性。根據 Graveland-Bikker等的研究結果［13］，為了提高產品的凝膠強度和減少乳清析出通常采用在對牛乳酸化前先進行熱處理，進而影響其穩定性。本試驗中，乳酸菌活菌數越高越好，沉淀率越低越好，所以綜合分析綜合優先選擇115℃/15 min的殺菌條件。

2.5 發酵工藝的正交試驗

根據單因素試驗結果，發酵工藝對沉淀率的影響較大，而對產品活菌數的影響不大，發酵72 h后，均大于1×109CFU/mL。因此，本研究以沉淀率為評價指標，在其他工藝條件一定的條件下，選取以A發酵時間，B殺菌條件，C發酵溫度，進行了3因素3水平的正交試驗(如表2)。

表1 正交試驗因素表Table 1 Factors and levels for L9(33)orthogonal array design

表2 正交試驗結果Table 2 L9(33)orthogonal array design and results

表3和表4為正交試驗結果和正交試驗方差分析結果。從表3和表4可以得出，影響乳飲料的沉淀率的因素由主到次依次為:A﹥C﹥B，由于本試驗中沉淀率越低，產品的穩定性越好，所以極差分析及方差分析得出的最佳水平為:A3B2C2，即發酵時間84 h，殺菌條件115℃，15 min，發酵溫度為37℃。

2.6 貯藏穩定性

對單因素及正交試驗結果進行驗證并進行貯藏穩定性研究。制得乳酸菌活菌數為8.5×108CFU/mL，沉淀率為1.1%。4℃冷藏的條件下產品中乳酸菌活菌數和沉淀率變化曲線如圖5所示。從圖5可以看出乳酸菌活菌數和沉淀率在冷藏期間均未發生顯著性變化。沉淀率在貯藏期后期升高，但沒有顯著性差異(P＞0.05)，儲藏杯底部有少量的沉淀出現，但無明顯的分層現象。

表3 正交試驗方差分析結果Table 3 Variance analysis of L9(33)orthogonal array design

圖5 貯藏期內乳酸菌活菌數和沉淀率的變化Fig.5 Effect of storage time on the viable count and precipitation rate

3 結論

通過研究鼠李糖乳桿菌對6種不同碳源的發酵特性，篩選出葡萄糖作為菌株的最適碳源。通過單因素和正交試驗確定工藝參數為:殺菌條件為115℃/15 min，發酵溫度為37℃，發酵時間為84 h，按照乳飲料工藝制乳酸菌活菌數為8.5×108CFU/mL，沉淀率為1.1%的鼠李糖乳桿菌發酵乳飲料。貯藏期內乳酸菌活菌數無顯著性變化，貯藏期內無明顯的分層及有極少量的沉淀出現，沉淀率無顯著性變化。

［1］ Tynkkynen S，Satokari R，Saarela M，et al.Comparison of ribotyping，randomly amplified polymorphic DNA analysis，and pulsed-field gel electrophoresis in typing of Lactobacillus rhamnosus and L.casei strains［J］.Applied and Environmental Microbiology，1999，65(9):3 908-3 904.

［2］ 王玉華，高晶，馮印，等.鼠李糖乳桿菌耐酸及膽鹽能力的研究［J］.食品科學，2008，29(12):449-451.

［3］ Petschow B W，Figueroa R，Harris CL，et al.Effects of feeding an infant formula containing Lactobacillus GG on the colonization of the intestine:a dose-response study in healthy infants［J］.Journal of Clinical Gastroenterology，2005，39(9):786-790.

［4］ Schultz M，Gottl C，Young R J，et al.Administration of oral probiotic bacteria to pregnant women causes temporary infantile colonization［J］.Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition，2004，38(3):293-297.

［5］ Pirkka V K，Arthur C O，Isolauri E，et al.The ability of probiotic bacteria to bind to human intestinal mucus［J］.FEMS Microbiology Letters，1998，167(2):185-189.

［6］ Amit-Romach E，Uni Z，Reifen R.Multistep mechanism of probiotic bacterium，the effect on innate immune system［J］.Molecular Nutrition ＆ Food Research，2010，54(2):277-284.

［7］ Viljanen M，Kuitunen M，Haahtela T，et al.Probiotic effects on faecal inflammatory markers and on faecal IgA in food allergic atopic eczema/dermatitis syndrome infants［J］.Pediatric Allergy and Immunology，2005，16(1):65-71.

［8］ Oksanen P，Salminen S，Saxelin M，et al.Prevention of traveler＇s diarrhoea by Lactobacillus GG ［J］.Annals of Medicine，1990，22(1):53-56.

［9］ Kaila M，Isolauri E，Sepp E.Fecal recovery of a human Lactobacillus strain(ATCC 53103)during dietary therapy of rotavirus diarrhea in infants［J］.Bioscience and Mieroflora，1998，17(2):149-150.

［10］ Hahtunen T，Kankaanpaa P，Tahvonen R，et al.Cadmium removal by lactic acid bacteria［J］.Bioscience and Mieroflora，2003，22(3):93-97.

［11］ Hudault S，Lievin V，Bemet-Camard M F，et al.Antagonistic activity exerted in vitro and in vivo by Lactobacillus casei(strain GG)against Salmonella typhimurium C5 infection［J］.Applied and Environment Microbiology，1997，63(2):513-518.

［12］ Agboola S O，Radovanovic-Tesic M.Influence of Australian native herbs on the maturation of vacuum-packed cheese［J］.LWT-Food Science and Technology，2002，35(7):575-583.

［13］ Graveland-Bikker J F，Anema S G.Effect of individual whey proteins on the rheological properties of acid gels prepared from heated skim milk［J］.International Dairy Journal，2003，13(5):401-408.