硒、鋅元素對羊肚菌多糖抗氧化性的影響*

黃玲玲，蘇彩霞，張宗申，金朝霞

1(大連工業大學生物工程學院，遼寧大連，116034)2(大連漢信生物制藥有限公司，遼寧大連，116034)

羊肚菌是一種名貴的大型食藥兼用真菌，羊肚菌多糖是其主要的活性有效成分之一［1］，具有抗腫瘤、降凝血、延緩衰老、提高機體免疫力等多種功效［1-3］，被應用到醫藥、食品和發酵等領域［2］。

目前，國內外對羊肚菌的研究主要關注于其發酵培養條件的優化及對多糖提取方法的研究［3-4］，對羊肚菌多糖抗氧化性能，及羊肚菌對Se、Zn等微量元素富集后生物活性的研究相對較少。

Se、Zn均為人體必需的微量元素［5］。為了研究Se、Zn元素對羊肚菌多糖抗氧化活性的影響，本實驗以亞硒酸鈉(Na2SeO3)和硫酸鋅(ZnSO4)的形式添加Se、Zn元素后，對羊肚菌進行發酵培養，菌絲體胞內多糖經分離提取后，測定其抗氧化活性［6］。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試菌種

羊肚菌(Morchella esculenta)，大連工業大學微生物實驗室保藏。

1.1.2 實驗試劑及儀器

主要試劑:體積分數95%乙醇，濃 H2SO4，水楊酸，鄰苯三酚，三羥甲基氨基甲烷(Tris)，30%H2O2，K4Fe(CN)6，抗壞血酸等均為分析純試劑。

主要儀器:紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司;低速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司;旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠;超聲脫氣機，昆山市超聲儀器有限公司等。

1.1.3 培養基

種子培養基［7］:蔗糖 30 g，蛋白胨 1 g，酵母膏 5 g，KH2PO41.5 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 自然。

發酵培養基［8］:蔗糖 40 g，酵母膏 5 g，NH4NO33 g，KH2PO41.5 g，MgSO4·7 H2O 1.5 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 5.5。

1.2 實驗方法

1.2.1 胞內多糖的制備

取干燥的羊肚菌菌絲體進行研磨粉碎，用超聲波兼熱水浸提提取多糖(400 W，60℃超聲40 min，60℃熱水浸提5 h)，對浸提液進行醇沉提取(加入3倍體積85%的乙醇充分攪拌后，在4℃下靜置24 h，3 000 r/min離心棄去上清液，沉淀用60℃水溶解)［9］。

乙醇提取獲得的多糖經Sevage法［10］除蛋白，獲得粗多糖(IPS)。

1.2.2 多糖濃度的測定

采用苯酚-硫酸法和DNS法分別測定總糖和還原糖的濃度，多糖濃度為兩數值之差［12］。

1.2.3 Se、Zn離子濃度的確定

分別在發酵培養基中加入Na2SeO3和ZnSO4(其他成分保持不變)［11］，使Se、Zn離子的最終質量濃度為0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.5 g/L，測定胞內多糖(IPS)得率和菌絲體干重(CDW)2項指標選擇合適的硒、鋅離子添加質量濃度。

1.3 多糖抗氧化性的研究

以抗壞血酸(VC)作對照，對多糖進行體外抗氧化活性研究。

1.3.1 總還原力的測定

K4Fe(CN)6法測定羊肚菌多糖的還原力［13-14］。將粗多糖稀釋成不同濃度梯度的樣品，每1 mL多糖樣品中加入0.2 mol/L pH 6.6的H3PO4緩沖液和1%K4Fe(CN)6溶液各2.0 mL，混合均勻，于50℃保溫20 min后，加入1.0 mL 10% 的三氯乙酸，混勻后3 000 r/min離心15 min，取上清液1 mL，加1 mL 0.1%FeCl3，充分混合，加蒸餾水定容至7 mL，靜置10 min后于700 nm處測定吸光度，吸光度值越大，表明還原力越高。

1.3.2 多糖對超氧陰離子自由基(O2-·)清除率的測定

采用鄰苯三酚自氧化法［16］。取 4.5 mL 50 mmol/L pH 8.2的Tris-HCl緩沖液于試管中，25℃水浴中預熱20 min，加入0.1 mL各樣品液，2.5 mmol/L鄰苯三酚0.5 mL，混勻后在25℃的水浴中反應6 min，立即加入0.1 mL 8 mol/L的HCl終止反應，并在320 nm處測定吸光值(以蒸餾水調零)，清除率計算:

式(1):AX代表樣品液和鄰苯三酚均加入的溶液吸光值;AX0表示不加鄰苯三酚的樣品吸光值;A0為不加樣品加入鄰苯三酚的溶液吸光值。

1.3.3 多糖對羥基自由基(·OH)清除率的測定

采用 Fenton體系［15-16］，該體系包括 16 mmol/L H2O21 mL、18 mmol/L FeSO41 mL、18 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液1 mL和不同濃度的樣品溶液1 mL。最后加入H2O2在37℃下啟動反應0.5 h，以蒸餾水為參比，在510 nm下測定各溶液的吸光度(VC作對照)。·OH清除率:

公式中:A0表示不加樣品，加入H2O2顯色劑的溶液吸光度;Ax為加入樣品溶液和H2O2顯色劑的溶液吸光度，Ax0為不加顯色劑H2O2的樣品溶液本底的吸光度值。

2 結果及討論

2.1 Se、Zn元素添加量的選擇

2.1.1 Se元素添加量的選擇

Na2SeO3的添加在一定濃度范圍內會對菌體的生長起到促進作用，但濃度過高，會抑制菌體的生長，如圖1所示，當Se元素添加的最終質量濃度為0.2 g/L時，菌絲體干重為(15.75±3.14)g/L，硒多糖(IPS-Se)得率也處于最高水平，為(16.05±0.65)mg/g，此時羊肚菌多糖的還原力吸光值為0.95±0.004，達到最高。考慮到菌體的生長量、多糖得率及還原力等因素，Se元素的適宜添加質量濃度為0.2 g/L。

圖1 Se濃度對菌體生長量、多糖得率和總還原力的影響Fig.1 Effect of selenium concentration on cell growth，polysaccharide yield and reducing power

2.1.2 鋅元素添加量的選擇

如圖2所示，當硫酸鋅的添加質量濃度為0.15 g/L時，菌絲體干重達到最高(16.21±2.31)g/L，多糖得率為(10.21±2.01)mg/g，總還原力為0.95±0.009，達到最高。由此可以看出，以ZnSO4的形式加入鋅元素在菌體生長良好的條件下，為獲得較高的多糖得率及較好的抗氧化活性，選擇的適宜濃度為0.15 g/L。

圖2 Zn濃度對菌體生長量、多糖得率和還原力的影響Fig.2 Effect of zinc concentration on cell growth，polysaccharide yield and reducing power

2.2 Se、Zn元素的添加對胞內多糖抗氧化性的影響

2.2.1 Se、Zn的添加對多糖還原力的影響

由圖3可以看出，多糖和VC均具有較高的還原力，且隨濃度的增加表現出良好的濃度相關性［9］。當多糖濃度為1 mg/mL時，Se多糖的還原力為0.979±0.632，近似于同濃度的 VC(0.981±0.052)，鋅多糖的還原力為0.821±0.302，是同濃度VC的4/5，普通多糖則相對較低，為0.710±0.132。

圖3 多糖和VC的還原力比較Fig.3 The reducing power of EPS and VC

2.2.2 硒、鋅的添加對多糖清除超氧陰離子自由基(O2-·)效果的影響

多糖對O2-·的清除能力與多糖濃度之間存在明顯的量效關系［9］(圖4)。

圖4 多糖和VC對O2-·的清除能力比較Fig.4 The scavenging ability of EPS and VC on O2-·

當樣品的濃度＜1 mg/mL時，其對O2-·清除率的大小為VC＞IPS-Se＞IPS-Zn＞IPS，當濃度＞1 mg/mL時，清除率為VC≈IPS-Se＞IPS-Zn＞IPS。可以看出，Se、Zn元素的添加，使羊肚菌多糖對O2-·的清除作用明顯增強，且隨濃度的增加，IPS-Se可以達到與VC相同的清除效果。

IC50為清除率達到50%時所對應的樣品濃度，其大小可作為判斷抗氧化活性強弱的一項指標，圖4所示，經過分析計算得出，VC、IPS、IPS-Zn、IPS-Se 清除50%的O2-·時所對應的濃度分別為(0.19±0.09)、(3.23±0.25)、(0.84±0.56)、(0.55±0.23)mg/mL，結果表明Zn、Se元素的添加，提升了胞內多糖的抗氧化活性，硒多糖抗氧化活性是普通胞內多糖的6倍，鋅多糖為普通胞內多糖的4倍。

2.2.3 Se、Zn的添加對多糖清除羥基自由基(·OH)效果的影響

根據圖5 分析 IC50值，結果為 VC、IPS-Se、IPS-Zn、IPS對·OH的清除率為50%時所對應的濃度分別為(1.39 ±0.56)、(2.01 ±1.23)、(4.23 ±1.25)、(4.45±0.95)mg/mL，Se的添加使羊肚菌胞內多糖對·OH的清除能力提高了2倍，是同濃度VC清除能力的1/2;但是Zn離子的添加，使羊肚菌多糖對·OH的清除作用不明顯。圖5中，當樣品濃度為5 mg/mL時，IPS-Se、IPS-Zn、IPS對·OH的清除率分別為(65.21±5.62)%、(60.03±3.25)%、(56.03±5.23)%，鋅多糖對·OH的清除率較普通多糖增加了4%。

圖4和圖5及IC50的數據分析說明:Se元素的添加增強了多糖的抗氧化性，而Zn元素的添加，總體增強效果不明顯，但對O2-·的清除率提高了3～4倍(ρ IPS(IC50)/(mg·mL-1)=3.23±0.25;ρ IPS-Zn(IC50)/(mg·mL-1)=0.84±0.56。

圖5 多糖和VC對·OH的清除能力比較Fig.5 The scavenging ability of EPS and VCon·OH

3 結論

本研究在進行羊肚菌的液體培養時添加適量的Na2SeO3和ZnSO4，使無機態的Se、Zn元素得到生物富集，形成有機態的復合物，提高了硒、鋅微量元素的穩定性，有利于人體的吸收利用，同時在不影響菌體生長的前提下，提高了羊肚菌多糖的抗氧化活性。

該研究通過單因素方法對Se、Zn離子的添加質量濃度進行選擇，確定了Na2SeO3的最適添加質量濃度為0.2 g/L，與孟凡云［17］在2010年對無機Se添加量的研究結果一致;ZnSO4的最適添加濃度為0.15 g/L，與Zhang［6］等研究無機Zn添加量的選擇相似。

羊肚菌多糖的體外抗氧化活性研究表明，Se、Zn微量元素的添加使多糖的抗氧化活性得到了提高，當多糖濃度為3 mg/mL時對O2-·的清除率與同濃度VC相同，這一點在其他食用菌對微量元素的生物富集中也有同樣的效果［18］。

研究中發現，羊肚菌多糖對O2-·的清除效果普遍高于對·OH的清除效果，當樣品濃度為1 mg/mL時，對 O2-·的清除率可達到98%(IPS-Se)，對·OH的清除率僅為30%左右(IPS-Se)，這可能是由于羥基之間易形成氫鍵，使較大分子質量的多糖溶解性降低，故而對·OH的清除率降低［19］。

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