反應溫度對雞骨蛋白酶解液美拉德產物光譜特性和抗氧化活性的影響

許丹，龔燕丹，沈燕飛，聶小華

(浙江工業大學海洋學院，食品科學與工程系，浙江 杭州，310014)

美拉德產物(MRPs)的抗氧化活性是國內外食品領域研究熱點之一。MRPs中含有類黑精、還原酮以及一系列含N、S雜環化合物，具有抗氧化性能，其中某些物質的抗氧化強度可與食品中常用的抗氧化劑相媲美［1］。Yilmaza等［2］發現組氨酸 -葡萄糖體系在100℃ 下加熱30 min，所得MRPs不具有抗氧化活性，而在120℃下反應不同時間，MRPs的過氧化自由基值顯著增加;魯偉等［3］亦發現精氨酸-葡萄糖反應體系的抗氧化能力隨著溫度的升高而逐漸增大。溫度會影響美拉德反應路徑從而影響其產物的生成［4］。

對MRPs抗氧化活性的研究已獲得一些成果，但是多集中于還原糖-氨基酸模型系統，而采用蛋白酶解物來提供氨基與還原糖反應的研究鮮見報道。本文采用雞骨蛋白酶解液與半乳糖在不同反應溫度下進行美拉德化修飾，研究其MRPs光譜特性和抗氧化活性，并將其產物清除DPPH自由基能力、羥基自由基清除能力和還原能力與反應進程進行關聯分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞骨架，市購，去除脂肪、雞肉部分;D-半乳糖，上海伯奧生物科技有限公司;鄰菲羅啉，天津市福晨學試劑廠;DPPH，Sigma-Aldrich上海有限公司;其余試劑均為分析純，購自于國藥集團化學試劑有限公司。

高速冷凍離心機，日本日立公司;紫外可見分光光度計，日本島津公司;SpectraMax M2多功能酶標儀，美國MD公司;CU-600電熱恒溫水浴鍋，上海福瑪實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 雞骨蛋白酶解液的制備

稱取一定量的雞骨架，加入1∶1.5(g∶mL)水后于130℃高壓蒸煮20 min，勻漿后冷卻至50℃加入復合酶(木瓜蛋白酶∶胰酶∶中性蛋白酶=1∶2∶1)200 g，酶解3.5 h后沸水浴滅酶，離心去沉淀，上清液即為水解度34%的雞骨蛋白酶解液。

1.2.2 雞骨蛋白酶解液MRPs的制備

將半乳糖添加到雞骨蛋白酶解液中，使之濃度達到2.4%，然后分裝于玻璃試管密封，于40、60、80、90、100℃下反應90 min，反應產物快速冷卻、離心，所得濾液即為雞骨蛋白酶解液MRPs。

1.2.3 褐變程度和中間產物的測定

將MRPs適度稀釋，分別于420 nm和294 nm下測定其吸光值。

1.2.4 內源性熒光測定

以347 nm為激發波長，發射波長為300～500 nm下測定MRPs的熒光強度。

1.2.5 DPPH自由基清除率測定

采用Morales等人［5］的方法并稍作修改。將1.5 mL 0.15 mmol/L DPPH溶液置于試管中，加入1.5 mL樣品液混勻，室溫下暗處放置30 min后，517 nm處測定其吸光值(Ai)。各組樣品對DPPH自由基的清除能力用抑制率R表示。

式中，Ac:1.5 mL DPPH加入1.5 mL去離子水;Aj:1.5 mL乙醇加入1.5 mL樣品液。

1.2.6 羥基自由基清除率測定［6］

取0.6 mL 5 mmol/L鄰二氮菲溶液，依次加入0.4 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖溶液(pH 7.4)，混合后加入0.6 mL 5 mmol/L FeSO4溶液，充分混勻，加入樣品2 mL以及0.4 mL 0.1%H2O2，于37℃水浴反應60 min，536 nm處測定吸光度A。

式中，A損:以去離子水代替樣品;A未損:以去離子水代替樣品和H2O2。

1.2.7 還原能力測定

采用鐵氰化鉀法［7］。取2 mL待測樣品，加入2 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖溶液(pH 6.6)和2 mL 1%鐵氰化鉀溶液混勻，50℃水浴加熱20 min，迅速冷卻后加入1 mL 10%三氯乙酸溶液，振蕩搖勻后離心(3 000 r/min，10 min)。取2 mL上清液加入2 mL去離子水，0.4 mL 0.1%FeCl3溶液，振蕩混勻后靜置10 min，700 nm處測定混合液吸光值。

1.2.8 數據處理與分析

每個試驗重復3次，測定結果表示為平均值±標準差。采用Origin 8.5及方差分析方法對實驗數據進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 反應溫度對雞骨蛋白酶解液MRPs褐變程度和中間產物生成量的影響

褐變程度是判斷美拉德反應進入最終階段的一個重要指標，常采用A420nm來檢測美拉德反應進行的程度。反應溫度對雞骨蛋白酶解液MRPs褐變程度影響如圖1所示。

圖1 反應溫度對雞骨蛋白酶解液MRPs褐變程度和中間產物生成的影響Fig.1 Effect of temperature on browning and intermediate products of MRPs

隨著反應溫度的升高，雞骨蛋白酶解液MRPs褐變程度增大，顏色加深，40℃下其A420nm僅為0.26，100℃時則達到0.50，這是因為自由氨基基團在較高溫度下更容易與還原糖發生美拉德反應，促進褐變反應進程［1］。

此外美拉德反應過程中會形成大量的中間產物，從而進一步聚合形成類黑精等高分子褐色物質，該中間產物在294 nm下有著明顯的紫外特征吸收峰。由圖1可知，雞骨蛋白酶解液MRPs的A294nm隨反應溫度的增加而增大，說明高溫下還原糖更容易發生脫水分解或裂解生成大量的中間產物［1］。

2.2 反應溫度對雞骨蛋白酶解液MRPs內源性熒光光譜的影響

美拉德反應中形成的中間產物一般具有熒光特性，Baisier等［8］認為熒光的積累是由于還原性化合物與胺類之間相互作用發生了不可逆反應而產生的。由圖2可知，雞骨蛋白酶解液MRPs在350 nm處有一個明顯的熒光吸收峰，且隨著反應溫度增加顯著下降，推測其可能是蛋白質中Phe、Trp或Tyr殘基所形成的;450 nm處亦有熒光吸收峰，符合美拉德產物的熒光特征，其熒光強度隨著反應溫度的升高(40～80℃)而增加，而后隨著反應溫度(90～100℃)的繼續升高而降低。較高的反應溫度有利于美拉德反應過程中熒光中間產物的形成和積累，但高溫下美拉德反應越容易進入終極階段，熒光中間產物相互間或與肽等聚合成高分子褐色物質，導致其積累速率降低，這也符合Benjakul等［7］發現的熒光動力學模式，即熒光強度先達到最大值而后降低。劉平等人在研究二甘肽-木糖美拉德反應體系時亦發現了347 nm和430 nm兩處熒光吸收峰［9］。

圖2 反應溫度對雞骨蛋白酶解液MRPs熒光光譜的影響Fig.2 Effect of temperature on flurorescence intensity of MRPs

2.3 反應溫度對雞骨蛋白酶解液MRPs清除DPPH自由基能力的影響

反應溫度對雞骨蛋白酶解液MRPs清除DPPH自由基能力的影響如圖3所示。當反應溫度為40～60℃時，雞骨蛋白酶解液MRPs清除DPPH自由基能力較低，僅為46.49%(40℃);而反應溫度高于80℃后，其產物清除DPPH自由基能力隨著反應溫度的升高而顯著升高，可達到86.18%(100℃)。章銀良等［1］亦發現酪蛋白-木糖模式美拉德產物對DPPH自由基的清除能力隨著反應溫度的升高而增加;趙晶等［10］則分別研究了80～100℃下酪蛋白-葡萄糖MRPs、酪蛋白-乳糖MRPs的抗氧化活性，結果表明反應溫度越高，MRPs對DPPH自由基的清除能力越強。這是因為較高溫度下能生成較多的類黑精、還原酮等物質，這些物質都具有清除DPPH自由基的能力［11］。

圖3 反應溫度對雞骨蛋白酶解液MRPs清除DPPH自由基能力的影響Fig.3 Effect of temperature on DPPH radical scavenging activity of MRPs

2.4 反應溫度對雞骨蛋白酶解液MRPs清除羥基自由基能力的影響

從圖4可知，反應溫度越高，雞骨蛋白酶解液MRPs清除羥基自由基的能力則越大，從0.48%(40℃)增加到14.81%(100℃)。該研究結果與章銀良等［1］報道相一致。但 Vhangani等［12］在對核糖-賴氨酸和果糖-賴氨酸模擬體系MRPs進行研究時發現，不同反應溫度下形成的MRPs在清除羥基自由基方面并不存在顯著性差異。與DPPH自由基清除能力相比，雞骨蛋白酶解液MRPs清除羥基自由基能力較低，這可能是由于MRPs金屬螯合能力干預了其羥基自由基清除能力［13］。Vhangani等［12］亦發現賴氨酸-糖模擬體系的DPPH自由基清除能力遠大于其對羥基自由基的清除能力。

2.5 反應溫度對雞骨蛋白酶解液MRPs還原能力的影響

圖4 反應溫度對雞骨蛋白酶解液MRPs清除羥基自由基能力的影響Fig.4 Effect of temperature on hydroxyl radical scavenging activity of MRPs

由圖5可知，雞骨蛋白酶解液MRPs有較好的還原能力，且還原能力隨著反應溫度的升高而增強，其中100℃下還原能力是40℃下的3倍。Vhangani等［12］表明121℃下賴氨酸-果糖MRPs的還原能力遠大于60℃下的還原能力;趙晶等［11］也發現100℃下酪蛋白-還原糖MRPs所呈現的還原能力最高。MRPs還原能力主要源于還原酮類物質和高溫下美拉德反應形成的褐色高分子聚合物類黑精，此類物質具有顯著的抗氧化性。

圖5 反應溫度對雞骨蛋白酶解液MRPs還原能力的影響Fig.5 Effect of temperature on reducing power of MRPs

2.6 相關性分析

美拉德反應產物光譜特性與其抗氧化活性之間存在著一定的關聯［11］，兩者之間相關性分析如表1所示。雞骨蛋白酶解液MRPs清除DPPH自由基能力與褐變程度、A294nm變化有著較好的線性關系，相關系數分別為0.908 4和0.929 6，這與孟艷麗［11］、沈軍衛［14］等人的結果相似。此外，雞骨蛋白酶解液MRPs的還原力與褐變程度、A294nm之間呈現正相關性，褐變程度越高和中間產物生成量越多，還原能力越強。Benjakul等［7］亦研究表明，豬血漿蛋白-糖 MRPs的還原力與褐變程度、A294nm之間顯著相關。但雞骨蛋白酶解液MRPs羥基自由基清除率與褐變程度、A294nm線性關系較差。

表1 MRPs的光譜特性和抗氧化活性間的相關分析Table 1 Correlation analysis betweenspectral characterisitics and antioxidant of MRPs

3 結論

對不同反應溫度下雞骨蛋白酶解液-半乳糖MRPs進行光譜特性和抗氧化能力分析，結果表明，MRPs褐變程度、中間產物生成量和熒光強度均隨著反應溫度的升高而升高;MRPs的自由基清除能力和還原能力亦隨之反應溫度的升高而增加，其DPPH自由基清除能力遠大于羥基自由基清除能力，說明雞骨蛋白酶解液-半乳糖MRPs具有良好的抗氧化活性。此外，MRPs的DPPH自由基清除能力和還原能力與其褐變程度、中間產物生成量有著良好的正相關性。

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