海產品中副溶血弧菌的LAMP-HNB快速檢測技術*

紀懿芳，胡文忠，姜愛麗，馮可

1(大連工業大學食品學院，遼寧大連，116600)2(大連民族學院生命科學學院，遼寧大連，116600)3(大連理工大學生命科學與技術學院，遼寧大連，116024)

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)，是一種常見的食源性致病菌，對人類危害極大，傳統的國標方法檢測操作繁瑣、耗時長，要做氧化酶實驗、圖片鏡檢、嗜鹽性實驗和生化實驗等步驟，因此，開發采用先進精確的生物化學方法，快速檢測副溶血性弧菌顯得尤為重要。環介等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是 Notomi［1］等在 2000 年開發的一種新型核酸恒溫擴增方法，近年來應用比較廣泛。LAMP檢測方法反應結果的判定有濁度分析、凝膠電泳和染料法等。濁度分析和凝膠電泳需要高昂設備和繁瑣的操作程序，因此，研究新型指示劑觀察反應結果在近幾年較為流行。本研究在LAMP反應基礎中加入新型指示劑羥基萘酚藍(hydroxy naphthol blue，HNB)，通過觀察體系顏色變化并判定反應結果，發生擴增的體系呈現出天藍色，而未反應的體系則仍保持著紫羅蘭色。經實驗證明LAMP-HNB方法反應結果可以直接用肉眼判斷，方便快捷，可有效避免污染和假陽性產生。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株:副溶血弧菌標準菌株(Vibrio parahemolyticus，CICC 21617)中國工業微生物菌種保藏中心;VP1、VP2為實驗室保存用于LAMP方法的特異性實驗;霍亂弧菌標準菌株(Vibrio cholera，CICC23794)、金黃色葡萄球菌標準菌株(Staphyloccocus aureus，ATCC6538)、鼠傷寒沙門氏菌標準菌株(Salmonella typhimurium enes，ATCC19111)、單核細胞增多性李斯特菌標準菌株 (L.monocytogenes，ATCC19111)、腸出血性大腸埃希氏菌標準菌株(Enterohemorrhage E.coli，CICC21530)、產腸毒素大腸埃希氏菌標準菌株(Enterotoxigenic Escherichia coli，CICC10414)、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium，CMCC(B)50071)蠟樣芽孢桿菌標準菌株(Bacilluscereus，CMCC(B63301)、腸侵襲性大腸埃希氏菌標準菌株(EIEC，CICC10661)、創傷弧菌標準菌株(Vibrio vulnificus，ATCC27562)、表皮葡萄球菌標準菌株(Staphylococcus，CMCC26069)、痢疾志賀氏菌標準菌株(Shigella，CMCC51105)、普通變形桿菌標準菌株(Proteusvulgaris，CMCC49027)、產氣腸桿菌標準菌株(Enterobacter aerogenes，ATCC13048)，由大連民族學院生命科學學院食品安全實驗室提供。

主要試劑:Bst DNA聚合酶，Thermopol反應緩沖液套裝(NEB)，betaine(Sigma Aldrich)，dNTP Mixture，MgSO4，100bp DNA ladder Maker，Taq 酶，10 ×buffer，MgCl2以及DNA marker，細菌基因組DNA 提取試劑盒(大連寶生物工程有限公司)，Tris，Na2EDTA·2H2O，冰乙酸，GelRed 染料，瓊脂，牛肉浸液，NaCl，TCBS瓊脂，3.5%氯化鈉三糖鐵斜面，HBI微生物生化鑒定條。

儀器:DYY-11型電泳儀電源，DYCP-31F型電泳儀，TC-512型PCR儀(Techne公司)，BioSpectrum 310凝膠成像系統(美國UVP公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA模板的制備

取1 mL過夜培養的副溶血弧菌菌懸液，19 830×g離心2 min，棄上清液，沉淀按照細菌基因組DNA提取試劑盒(大連寶生物工程有限公司)說明，提取細菌基因組DNA。

1.2.2 引物設計與合成

以副溶血弧菌不耐熱溶血素tlh為目標基因序列，根據引物在線設計軟件設計Primer Explorer 4.0，在線設計一套LAMP引物，由寶生物工程(大連)有限公司合成，引物序列見表1。

表1 副溶血性弧菌LAMP引物Table 1 The primer sequences of LAMP

1.3 擴增體系

1.3.1 LAMP-HNB擴增體系

反應體系25 μL:10×反應緩沖液(New England Biolabs)2.5 μL，dNTPs Mixture(TaKaRa)1.4 mmol/L，外引物 F3/B3各 0.2 μmol/L，內引物 FIP/BIP 各1.6 μmol/L，MgSO41.5 μL，甜菜堿(Sigma)1 mol/L，Bst DNA聚合酶大片段(New England Biolabs)8U，細菌 DNA 模板 2 μL，HNB 1 μL(反應濃度 150 μmol/L)［2］，ddH2O 補足至25 μL，配制好混勻離心，于 65 ℃溫育60 min，80℃滅活10 min，產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，同時肉眼觀察反應體系的濁度和顏色變化。

1.3.2 PCR擴增體系

反應體系 25 μL:包括 10 × PCR Buffe 2.5 μL(TaKaRa)，MgCl22 μL(TaKaRa)，dNTP 2 μL(TaKa-Ra)，上下游引物F3/B3各50 nmol/L，DNA模板2.5 μL，Taq DNA 聚合酶 0.3 μL(TaKaRa)，ddH2O 補齊25 μL。反應程序:預變性95℃ 5 min;95℃ 30 s;58℃ 30 s;72℃ 45 s;30個循環，72℃延伸10 min。擴增產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。

1.4 特異性實驗

采用LAMP-HNB和PCR方法對4株副溶血弧菌菌株和14株非副溶血弧菌菌株進行擴增，觀察實驗結果。

1.5 靈敏度實驗

1.5.1 基因組DNA靈敏度檢測

用試劑盒提取副溶血弧菌基因組DNA，用酶標儀測定OD值計算DNA濃度，10倍比例稀釋DNA原液到10-1～10-9，同時進行LAMP-HNB和PCR反應。

1.5.2 細菌純培養物靈敏度檢測

取振蕩過夜培養的副溶血弧菌菌液，平板稀釋法計算菌液濃度，10倍比例稀釋10-1～10-8，用LAMPHNB法檢測靈敏度，同時做PCR實驗。

1.5.3 人工污染副溶血弧菌食品檢測

取經國標方法檢測不含副溶血弧菌的牡蠣樣品25 g加入到225 mL的NaCl堿性蛋白胨水中，用拍擊式均質機均質2 min。取8 mL均質液加入已知濃度為1.4×108～1.4×10 CFU/mL濃度梯度的副溶血弧菌純菌各2 mL，各取1 mL用試劑盒法提取DNA，提取DNA同時做LAMP檢測和PCR檢測。

1.6 對市售海產品進行檢測

從市場中采購海產品，其中包括帶魚、魷魚、海蠣子、花蜆子和多春魚等40份。采用無菌操作的方法取魚肉、魚內臟、貝肉和蝦腹節肌肉等25g加入到225 mL堿性蛋白胨水，均質，(36±1)℃培養12～18 h，接種到TCBS瓊脂上，挑選可疑菌落接種于3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板，(36±1)℃培養18～24 h，按照GB/T4789.7—2013要求進行革蘭氏鏡檢、氧化酶實驗、嗜鹽性實驗、氯化鈉三糖鐵實驗等生化鑒定試驗，同時取1 mL菌液按照(1.2.1)所提的方法，按照細菌基因組DNA提取試劑盒要求提取DNA用于LAMP-HNB和PCR實驗。

2 結果與討論

2.1 LAMP檢測方法的建立

針對副溶血弧菌tlh基因設計特異性引物進行擴增，根據羥基萘酚藍指示劑的顯色原理，羥基萘酚藍(HNB)是一種金屬離子指示劑，Mg2+與HNB結合使得反應體系初始顏色為紫羅蘭色，隨著反應的進行，Mg2+與析出的焦磷酸根離子反應生成焦磷酸鎂沉淀，羥基萘酚藍失去了Mg2+使得體系顏色變為天藍色，而未反應的體系則仍保持著紫羅蘭色，以此判斷LAMP反應結果。如表2所示，LAMP-HNB發生擴增反應的反應管變為天藍色，而未發生擴增反應的反應管仍保持紫羅蘭色。如圖1和圖2所示，LAMP反應產物在瓊脂凝膠電泳上出現典型的LAMP反應階梯狀條帶，肉眼觀察反應管有較明顯的沉淀出現，PCR方法觀察反應結果在207 bp處也有較明顯的條帶。

表2 弧菌標準菌株LAMP-HNB檢測結果Table 2 LAMP-HNB result of VP standard strain

圖1 弧菌標準菌株LAMP檢測結果Fig.1 LAMP result of VP standard strain

圖2 副溶血弧菌PCR檢測結果Fig.2 PCR result of VP standard strain

2.2 特異性實驗

如表3、4 和圖3、4、5、6 所示，4 株副溶血弧菌菌株(1、2、3、14號反應管)LAMP和PCR反應均出現特異性擴增條帶，LAMP-HNB體系顏色為天藍色(1、2、3、14號反應管顏色為天藍色)，其他14株非副溶血弧菌(4～12、13、15～16號反應管)未出現特異性擴增條帶，LAMP-HNB仍保持紫羅蘭色(4～12、13、15～16號反應管顏色為紫羅蘭色)，反應有較強的特異性。

表3 HNB特異性檢測結果Table 3 Specificity of HNB assay

表4 HNB特異性檢測結果Table 4 Specificity of HNB assay

圖3 LAMP特異性實驗Fig.3 Specificity of LAMP assay

2.3 靈敏度實驗

2.3.1 基因組DNA靈敏度

圖4 LAMP特異性實驗Fig.4 Specificity of LAMP assay

副溶血弧菌基因組DNA濃度為5.45×106fg/μL，10倍比例稀釋進行LAMP檢測，如表5和圖7、圖8所示，從反應管顏色變化和凝膠電泳圖中可以判斷，LAMP-HNB檢測副溶血弧菌基因組DNA檢測限約為54.5 fg/μL。用同樣的基因組DNA進行PCR反應，當菌液濃度為5.45×103fg/μL時PCR反應不產生擴增條帶。因此，LAMP-HNB檢測副溶血弧菌純培養物的最低檢測限為PCR的100倍(1號空白反應管和9～11號反應管都為紫羅蘭色，2～8號反應管為天藍色)。

表5 HNB檢測基因組DNA的靈敏度Table 5 Detection limit of HNB for genomic DNA

圖5 PCR特異性實驗Fig.5 Specificity of PCR assay

圖6 PCR特異性實實驗Fig.6 Specificity of PCR assay

圖7 LAMP檢測基因組DNA的靈敏度Fig.7 Detection limit of LAMP for genomic DNA

圖8 PCR檢測基因組DNA的靈敏度Fig.8 Detection limit of PCR for genomic DNA

2.3.2 副溶血弧菌純培養物靈敏度

采用平板菌落計數法得原菌液濃度為1.4×108CFU/mL，把原菌液進行10倍比例稀釋，各稀釋梯度的菌液提取DNA進行擴增反應，如表6和圖9、10所示，LAMP-HNB發生擴增的反應體系顏色變為天藍色，而未反應的則為紫羅蘭色，LAMP-HNB方法檢測靈敏度為140 CFU/mL，LAMP產物凝膠電泳結果與LAMP-HNB相同，PCR檢測方法的檢測靈敏度為1.4×103CFU/mL(1號空白反應管和8、9號反應管都為紫羅蘭色，2～7號反應管為天藍色)。

表6 HNB靈敏度檢測結果Table 6 Detection limito of HNB

圖9 LAMP檢測純培養物靈敏度Fig.9 Detection limito of LAMP

2.3.3 人工污染副溶血弧菌的食品檢測

人工污染副溶血弧菌的牡蠣樣品中的菌液濃度為2.8×107～2.8×100CFU/mL。如表7和圖11、12所示，人工污染副溶血弧菌的牡蠣樣品LAMP方法的最低檢出限為2.8×102CFU/mL，平行PCR方法的檢出限為2.8×103CFU/mL。

圖10 PCR檢測純培養物靈敏度Fig.10 Detection limito of PCR

表7 人工污染食品樣品中副溶血弧菌HNB檢測結果Table 7 The HNB result of VP inartificially contaminated food samples

圖11 人工污染食品樣品中副溶血弧菌LAMP檢測結果Fig.11 The LAMP result of VP inartificially contaminated food samples

2.4 市售海產品的實際檢測

對市售海產品40份分別進行LAMP-HNB檢測、PCR檢測和國標方法檢測。其中LAMP-HNB法檢出15份為陽性，25份為陰性，PCR檢出15份為陽性25份為陰性，國標方法檢出15份為陽性25份為陰性，檢出率為38%。其中貝類的感染率最高，高達47%。以國標方法為標準，LAMP-HNB方法的檢出率符合率為100%。

圖12 人工污染食品樣品中副溶血弧菌PCR檢測結果Fig.12 The PCR result of VP inartificially contaminated food samples

表8 市售海產品檢測結果Table 8 Commercial seafood test

3 結論

LAMP-HNB方法用HNB判斷反應結果，隨著反應的進行，Mg2+與析出的焦磷酸根離子反應生成焦磷酸鎂沉淀，羥基萘酚藍失去了Mg2+使得體系顏色變為天藍色，而未發生反應的體系則仍保持著紫羅蘭色，以此判斷LAMP反應結果。LAMP-HNB方法檢測特異性強，對單增李斯特菌標準菌株等非副溶血弧菌的食源性致病菌行LAMP-HNB擴增反應，LAMPHNB終反應體系為紫羅蘭色，對副溶血弧菌標準菌株進行LAMP-HNB擴增反應，反應體系變為天藍色，二者顏色差別明顯，可以較為準確區分。LAMP-HNB方法檢測靈敏度較高，對于基因組DNA的檢測限約為54.5 fg/μL，細菌純培養物檢測限約為140 CFU/mL，這與徐芊［3］、程曉艷［4］等報道采用 LAMP 檢測結果基本相符，同時低于祝孺剛［5］、劉琦［6］等報道的采用PCR檢測結果。

LAMP反應過程產生大量的焦磷酸鎂沉淀，可通過肉眼直接觀察，但較為難斷定。常用的判斷LAMP反應結果等方法有濁度分析、凝膠電泳和染料等。但是濁度分析和凝膠電泳法需要高昂設備和繁瑣操作程序，所以研究新型指示劑觀察反應結果在近幾年較為流行。現常用的染料主要有 SYBR green［7］、鈣黃綠素［8］和 HNB［9］等。HNB 和鈣黃綠素可以在 LAMP反應前加入，有效的減少了反應污染的可能性，其他染料(如SYBR green)則需要在反應后加入，加重了污染的可能性，若通過反應前將指示劑滴加在蓋上，反應后彈入等方法則操作不容易控制。羥基萘酚藍(HNB)是一種金屬離子指示劑，原理是Mg2+與HNB結合使得反應體系初始顏色為紫羅蘭色，隨著反應的進行，Mg2+與析出的焦磷酸根離子反應生成焦磷酸鎂沉淀，羥基萘酚藍失去了Mg2+使得體系顏色變為天藍色，而未反應的體系則仍保持著紫羅蘭色，以此判斷LAMP反應結果。本實驗在反應前加入1 μL(反應濃度150 μmol/L)HNB染料觀察顏色變化判定反應結果，并同時將產物進行凝膠電泳，發現二者結果相同，此結果與聶凱［10］等人報道的應用HNB檢測甲型H1N1流感病毒，呂恒［11］等人報道的應用HNB檢測大腸埃希菌結果相同，證明HNB有較強的準確性。

副溶血弧菌廣泛的存在于海產品及沿海環境中，國內外的報道中副溶血弧菌的分離率高達68.12%［12］和 78.6%［13］，不同類別的海產品感染率不同，其中貝類副溶血弧菌污染較為突出，最高可達75%［14］，本文在幾種海產品檢驗中也屬貝類的感染率最高，可以達到50%。人們在購買海產品時要合理安排好貯藏溫度和時間，防止交叉感染。在食用海產品時要盡量避免生食，要進行充分的熱處理，隔夜的餐食食用前要充分加熱，必要時可以加食醋調味殺菌。

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