離子排斥色譜法分析發酵液中甘油酸等代謝產物*

方亞坤，靳魁奇，劉宇鵬

(河南大學生命科學學院生物工程研究所，河南開封，475004)

甘油是一種多羥基化合物，為甘油三脂的骨架成分，是脂肪分解和生物柴油燃料生產(這一過程會產生約10%～14%左右的甘油)［1］過程中的一種副產品。甘油具有很多的工業用途，它被廣泛地應用于化妝、涂料、汽車、食品、煙草、制藥和紡織工業等［2］。隨著生物燃料的發展，越來越多的甘油副產物產生，因此在過去的十年間，化學和生物工程的研究者付出很多努力探索將甘油轉化成具有更高價值化學物質的方法［3］。而氧化甘油轉化為1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、二羥基丙酮、甘油酸等物質則是其中一條重要途徑。

甘油酸又稱2，3-二羥基丙酸，它是自然界各種各樣植物中的化學成分，作為一種代謝物它在人體內也存在。甘油酸以及甘油酸的衍生物具有很好的生物學功能:在人體內D-甘油酸能使胃部細胞在一定劑量乙醇刺激后增強活力從而促進乙醇分解代謝;有報道稱在狗體內的甘油酸具有膽固醇活性和肝興奮劑的功能;甘油酸衍生出的酯類低聚物能表現出抗胰蛋白酶活性［4-5］，甘油酸的磷酸鹽衍生物是糖酵解途徑的一個重要中間產物。所以氧化甘油生產甘油酸，可充分利用生物燃料行業的廢棄物，具有很大的市場潛力。氧化甘油生產甘油酸有化學法和生物法。化學方法成本高、耗能大、產量低并且不具有立體選擇性因而很少被采用。利用微生物發酵法生產甘油酸，環境溫和、產量高、方法簡便而且產物具有立體選擇性，因此越來越受到關注。但是，目前國外關于甘油酸發酵的研究非常少，國內還尚無任何關于甘油酸發酵的研究報道［6-8］。據報道，在有氧條件下利用細菌生產甘油酸的菌種大多屬于醋酸桿菌屬，它們在氧化甘油的生產過程中會生成副產物二羥基丙酮。

通常測定發酵液中有機酸的方法［9］包括酶法、氣相色譜法(GC)及高效液相色譜法(HPLC)。HPLC法靈敏、準確、簡便，不需對樣品進行復雜的預處理，因此本文首次嘗試采用HPLC法同時檢測發酵液中的甘油酸、二羥基丙酮和甘油的含量。檢測時選擇高交聯度磺化苯乙烯-二乙烯基苯共聚物多孔微球作為固定相的Aminex HPX-87H離子色譜柱為分析柱，該色譜柱以離子排斥法為主，并且集合了離子交換、配位體交換、反相及正相等多種分離機制，這種多方式的交互作用具有很好的分離混合物的能力［10］。到目前為止，國內外尚未有同時檢測發酵液中甘油酸、二羥基丙酮和甘油的報道。此外，本文還研究了不同分析色譜條件對甘油酸、甘油和二羥基丙酮分離效果的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器及色譜條件

1.1.1 儀器

Waters 1515高效液相色譜儀、Waters2414示差折光檢測器、Waters 2489紫外可見光檢測器、2707自動進樣器、Breeze色譜工作站，美國;SHB-Ⅲ循環水式多用循環泵，鄭州長城科技工貿有限公司;QHZ-98A全溫振蕩培養箱，太倉市華美生化儀器廠。

1.1.2 色譜條件

色譜分離柱:BioRad公司Aminex HPX-87H色譜柱(300 mm ×7.8 mm×9 μm);Waters 2414示差折光檢測器。

起始色譜條件:流動相5 mmol/L H2SO4;柱溫60 ℃;流速 0.5 mL/min;進樣量20 μL。

優化后色譜條件:流動相5 mmol/L H2SO4和20%乙腈;柱溫 60℃;流速 0.3 mL/min;進樣量20 μL。

1.2 材料與試劑

1.2.1 試劑

標準品甘油酸(20%水溶液，東京化成工業株式會社);二羥基丙酮;甘油。以上標準品均為分析純。乙腈和濃H2SO4均為色譜純。

1.2.2 實驗菌株和培養基

菌種:氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans 1.637)，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

種子培養基(g/L):多聚蛋白胨5，酵母粉 5，葡萄糖 5，MgSO4·7H2O 1，pH 6.5。

發酵培養基(g/L):甘油100，多聚蛋白胨 9，酵母粉 1，KH2PO40.9，K2HPO40.1，MgSO4·7H2O 1，pH 6.5。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

精確稱取二羥基丙酮標準品0.05 g，置于25 mL的容量瓶中，用含20%乙腈的5 mmol/L的H2SO4稀釋至刻度線，得到濃度為2 g/L的標準品儲備液。精密吸取1、2、3、4、5 mL標準品儲備液分別置于10 mL容量瓶中，用20%乙腈5 mmol/L的H2SO4稀釋至刻度線。得到梯度濃度的二羥基丙酮標準溶液。

甘油酸的標準品為20%的水溶液(2 mol/L)，取236 μL 20%的甘油酸標準品置于25 mL容量瓶中用含20%乙腈的5 mmol/L的H2SO4稀釋至刻度線得到2 g/L的甘油酸標準品溶液。然后按照和二羥基丙酮同樣的方法進行稀釋。

利用和二羥基丙酮同樣的方法來配制甘油的不同濃度梯度的標準品溶液。

1.3.2 發酵條件

一級種子培養:30℃、160 r/min振蕩培養24 h。

二級種子培養:30℃、160 r/min振蕩培養10 h。

發酵培養:種子生長到對數期時，按5%的接種量接入500 mL的三角瓶中，30℃、200 r/min振蕩培養3 d。

1.3.3 樣品處理

取10 mL發酵液，經離心除去菌體和沉淀物，然后將離心所得上清液稀釋10倍，再用0.45 μm的微孔濾膜過濾得到濾液放入冰箱備用。

1.3.4 甘油酸的提取與純化［11］。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇

甘油酸屬于一種有機酸，實驗中選擇了Aminex HPX-87H離子排斥色譜柱來分析發酵液中的甘油酸、二羥基丙酮和甘油等物質。據Chinnici［12］等人報道，Aminex HPX-87H色譜柱可以使用 H2SO4和H3PO4作為流動相來分析有機酸和糖類。因為H3PO4有可能和發酵液中的金屬離子產生沉淀，所以本文選用了H2SO4作為流動相。實驗中發現當H2SO4作為流動相時溫度的變化對物質的分離效果沒有顯著影響。實驗發現甘油酸和二羥基丙酮與甘油的分離效果良好，但是由于二羥基丙酮與甘油的結構式相似，在不同的流速下發酵的副產物二羥基丙酮和剩余的甘油的分離效果不是很理想，因此本實驗選擇在流動相中添加了一定濃度的乙腈以改善分離效果。

2.2 流動相中乙腈的濃度及流速的條件優化

本實驗中發現在色譜柱溫對發酵液中各成分的分離影響較大(數據未列出)。柱溫為常溫時分離效果較差;柱溫為高溫(40～60℃)時分離效果較好，因而本文選用的色譜柱溫為60℃。在實驗中，選擇乙腈濃度和流速兩個因素進行優化。其中流動相中乙腈濃度分別為10%，15%，20%，流速分別選擇了0.3，0.4，0.5，0.6 mL/min，共 12 個分析條件，甘油酸、甘油、二羥基丙酮等混合標準品的分析結果如圖1所示。

實驗結果表明，甘油酸色譜峰的保留時間與二羥基丙酮和甘油相距較大，因而甘油酸很容易和其他物質分開，但底物甘油和副產物二羥基丙酮的分離比較困難。從圖1中可以看出，當流速一定時，隨著流動相中乙腈含量的升高，甘油和二羥基丙酮的分離效果得到提高，因而選擇20%的乙腈含量為最終的分析條件。在乙腈濃度為20%時，隨著流動相流速的增加，甘油和二羥基丙酮的保留時間趨于一致，分離效果變差，因而選擇流速為0.3 mL/min。使用優化后的色譜條件，對甘油酸、甘油、二羥基丙酮混合標樣進行分析，結果如圖2所示，表明3種物質得到了良好的分離。

圖1 乙腈濃度和流動相流速對甘油酸、甘油、二羥基丙酮保留時間的影響Fig.1 Effect of flow rate and concentration of mobile phase on retentiontime of glyceric acid，dihydroxyacetone and glycerol

圖2 優化后的混合標樣色譜圖Fig.2 Optimized HPLC figure of mixed standard sample

2.3 線性關系實驗

按照1.3.1的方法配制標準品溶液。以峰面積外標法定量，然后根據峰面積(Y)和標準品濃度(X)的關系繪制標準曲線，結果如表1所示。

表1 甘油酸、二羥基丙酮和甘油的回歸方程、相關系數和線性范圍(n=5)Table 1 The regression equation，correlation coefficient and linear range of glyceric acid，dihydroxyacetone and glycerol(n=5)

從表1的結果可以看出甘油酸、二羥基丙酮和甘油各組分在各自線性范圍內線性關系良好。

2.4 回收率實驗與分析方法的精密度

取100 mL空白發酵液，分別加入標準樣品甘油酸、二羥基丙酮和甘油1.0 g，采用與樣品相同的處理方法和相同的色譜條件，每個標品重復5次。結果見表2。

表2 甘油酸、二羥基丙酮和甘油標準樣品的回收率和精密度(n=5)Table 2 Recovery rate and precision of the glyceric acid，dihydroxyacetone and glycerol(n=5)

從表2中可以看出，該方法對于甘油酸、二羥基丙酮和甘油的分離檢測效果良好，他們的相對標準偏差RSD分別為1.31%、1.35%和1.61%，說明該方法的精密度較好。

2.5 重現性實驗

取同一個發酵的樣品按1.3.3的方法處理，并按上述一樣的色譜條件進樣，重復進樣8次。計算甘油酸、二羥基丙酮和甘油的相對標準偏差RSD分別為1.46%、1.72%、1.87%，說明該方法對甘油酸、二羥基丙酮和甘油的重現性較好。

2.6 發酵產物的測定

取不同的5批發酵液，按照1.3.3的處理方法對這5批發酵液進行處理，然后按照上述相同的色譜條件進行分析檢測色譜結果如圖3所示。

圖3 發酵液的液相色譜圖Fig.3 The HPLC figure of fermentation broth

3 結論

本文采用Aminex HPX-87H為色譜柱建立對甘油酸、二羥基丙酮和甘油進行分離檢測方法，但是以5 mmol/L H2SO4為流動相時二羥基丙酮和甘油的分離效果不好，對此本研究對流動相中乙腈的濃度和流速進行優化，優化結果為乙腈濃度為20%、流速0.3 mL/min。在此方法下，甘油酸、二羥基丙酮和甘油在0.2～1.0 g/L線性范圍內相關系數R2分別為0.999、0.994和0.992，線性關系良好，彼此的平均回收率分別為(99.52 ±1.30)%，(97.61±1.33)%，(98.52±1.58)%。分離效果高，精密度和準確度較好。

實驗結果表明，該方法具有分離效果好、定性及定量準確、分析時間較短等優點，對于分析發酵液中有機酸、多元醇及酮類物質具有很好的參考價值，非常適合于微生物發酵方法生產甘油酸過程中底物及產物的及時分析與監測。

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