混合菌種發酵生產的低酸度川味香腸揮發性成分分析*

鞏洋，孫霞，楊勇，張楠，郭艷婧，李誠，胡濱，何利

(四川農業大學食品學院，四川雅安，625014)

川味香腸是我國特色的傳統腌臘肉制品，其揮發性物質是一種重要的品質指標，對于川味香腸新產品的開發、標準化生產和質量控制有著重要的意義。發酵香腸的風味物質形成途徑主要有碳水化合物的分解、脂肪氧化、蛋白質的降解，而微生物和環境條件(溫度和相對濕度)會對風味物質的種類和含量產生影響［1-2］。

乳酸菌對香腸的風味形成起重要作用，其貢獻主要來自于發酵碳水化合物產生的乙酸和乳酸，同時會產生某些揮發性風味物質［3］。Larrouture 等［4］研究發現，植物乳桿菌具有分解脂肪的能力，脂肪降解產物是發酵香腸揮發性成分的重要來源。Papamanoli等［5］從希臘干發酵香腸中分離的乳酸菌具有分解蛋白的能力，而某些蛋白降解產物是形成發酵香腸揮發性成分的前體物質。此外還有學者研究發現，自然發酵香腸中的某些葡萄球菌和微球菌也具有蛋白質降解能力，接種此類發酵劑可以提升發酵香腸的風味［6］。

本研究通過以植物乳桿菌、戊糖片球菌和葡萄球菌作為發酵劑并在智能化控溫控濕條件下生產低酸度川味香腸，利用頂空固相微萃取技術和氣相色譜-質譜聯用技術對其揮發性成分及其相對含量進行檢測和分析，比較4組川味香腸揮發性成分及其相對含量的差異，為進一步研究低酸度的川味香腸風味物質的形成機理打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

發酵菌種:植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、戊糖片球菌(Pediocossus pentosaceus)、葡萄球菌(Staphylococcus)均由食品學院肉品研究室從傳統四川香腸中分離得到［7-8］。新鮮豬后腿肉、腸衣、食鹽、白砂糖等調味料購于當地農貿市場。

LHS-250SC型恒溫恒濕培養箱，上海榮豐科學儀器有限公司;DHG29345A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒公司;PHS-3C型酸度計，上海儀電科學儀器股份有限公司;SW-GJ-IFD型超凈工作臺，蘇凈集團泰安公司;Agilent7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀［配有HP-5MS彈性石英毛細管柱(30 mm×0.25 mm，0.25 μm)］，美國安捷倫公司;萃取頭 75 μm Carboxen PDMS萃取頭，美國Supelco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 川味發酵香腸的制作

本研究在單因素實驗和正交實驗等前期工作的基礎上，確定了低酸度川味香腸(pH值為5.50)的工藝參數為:發酵溫度20℃，發酵時間12 h，葡萄糖添加量0.10%，發酵相對濕度75%;成熟溫度13℃，成熟時間4 d，成熟相對濕度60%。

實驗分為4個處理，以字母A、B、C、D表示。A是接種1∶1∶1比例復合的植物乳桿菌、戊糖片球菌和葡萄球菌作為發酵劑，通過智能化控溫控濕生產的低酸度川味香腸;B是不接種發酵劑并在智能化控溫控濕條件下生產的川味香腸;C是接種1∶1∶1比例復合的植物乳桿菌、戊糖片球菌和葡萄球菌作為發酵劑，在自然條件下(環境溫度為8～15℃，相對濕度為75%～90%)生產的川味香腸;D是不接種發酵劑，在自然條件下(環境溫度為8～15℃，相對濕度為75%～90%)生產的傳統川味香腸。

發酵液制備:將植物乳桿菌和戊糖片球菌接種到液體MRS培養基中，將葡萄球菌接種到液體MSA培養基中，在30℃條件下培養24 h，菌種活化2次，血球計數法計數，直至達到106CFU/g以上。

工藝流程:原料肉→預處理→絞碎→攪拌→接種→灌腸→發酵→成熟→干燥(55℃，24 h)→成品。

1.2.2 感官評價

采用感官評定之描述定量分析法(quantitative described analysis，QDA)［9］，邀請 10 名有品評經驗的人員，分別從滋味(30分)、香氣(30分)、色澤(25分)和外觀(15分)進行評定，滿分100分，評定標準見表 1［10］。

表1 川味香腸感官評價標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of Sichuan-tppe sausage

1.2.3 揮發性物質檢測

取絞碎的香腸樣品5 g于15 mL頂空進樣瓶中，封蓋后在60℃水浴下加熱30 min，將萃取頭插入到頂空瓶中萃取30 min。取出萃取頭插入到GC-MS儀氣相色譜進樣口，250℃條件下解析5 min。

講座結束后，畢宏生與山東中醫藥大學附屬眼科醫院的專家們開展了義診活動，為240余名機關干部職工和住地武警官兵作了眼健康體檢。

1.2.4 GC-MS條件

色譜條件:HP-5MS彈性石英毛細管柱(30 mm×0.25 mm，0.25 μm);載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min;進樣口溫度250℃，初始溫度35℃，保持3 min，然后以3.0℃/min升至140℃并保持1 min，再以10℃/min升至250℃，保持6 min。

質譜條件:電子源EI，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，GC-MS傳輸線溫度280℃;溶劑延遲時間為1.5 min;掃描范圍為50～550 amu。

1.2.5 揮發性成分的定性定量方法

檢測的未知化合物通過NIST08.LIB標準譜庫進行對比匹配，取匹配度大于800的鑒定結果，結合文獻進行人工譜圖解析，確定其化學成分，利用峰面積歸一化方法計算相對百分含量。

2 結果與分析

2.1 川味香腸的感官評價結果

對4種不同加工條件下的川味香腸進行感官評價，感官評價結果見表2。

表2 川味香腸感官評價結果Table 2 Sensory evaluation of Sichuan-style sausage

從表2中可以看出，4種川味香腸的感官評分結果從大到小依次是:A、C、D和B，即人工控溫控濕并接種混合發酵劑生產的低酸度川味香腸的風味相對較好。

2.2 四種川味香腸主要揮發性成分檢測結果

采用SPME-GC-MS法分析檢測4種川味香腸的揮發性成分及相對含量見表3。

2.2.1 四種川味香腸的揮發性成分種類數量差異

4種川味香腸中共鑒定出揮發性成分80種，其中酯類10種，醇類8種，醛類7種，酮類7種，酸類5種，脂肪烴類37種，其他類物質6種。A、B、C、D四組川味香腸中分別鑒定出57種、41種、49種和49種揮發性風味成分。其中脂肪烴類和酯類物質的種類數在4種川味香腸中較豐富，但不同工藝條件下生產的川味香腸產品中風味物質的種類數及個體風味成分存在差異。

就個體風味成分而言，芳樟醇在4種川味香腸中含量均較高，相對含量均超過10%。除此之外，乙酸芳樟酯和右旋萜二烯在川味香腸中的相對含量也較高。A組(低酸度川味香腸)中含有相對含量較高的乙酸(1.35%)和十六酸(0.85%)，此外乙二酸、甲氧基乙酸和己酸為A組香腸所特有的風味成分。

表3 4種川味香腸中揮發性成分及相對含量測定結果Table 3 Volatile components and their relative contents four kinds of Sichuan-style sausage

續表3

2.2.2 四種川味香腸的主要揮發性風味物質相對含量差異

就醇類物質而言，川味香腸中醇類的來源比較廣泛，其中大多來源于微生物碳水化合物的代謝，如乙醇;此外，還有一部分來源于脂肪氧化，如1-辛烯-3-醇，由于它閾值較低，因此對川味香腸的風味形成具有一定作用，這與Larrouture［4］等研究植物乳桿菌具有脂肪降解能力的結論相一致。A組香腸中醇類物質相對含量為21.29%，高于 B組、C組和D組的17.91%、15.94%和14.63%。雖然醇類物質的閾值較高，但它具有香甜花香味，且對醛類和酯類等物質的產生必不可少，從而會改善香腸的整體風味。

就酯類物質而言，它是促進川味香腸風味形成的重要物質，1～10的酸生成的酯一般賦予發酵香腸果香甜味的特性，能體現發酵香腸的典型風味，如辛酸乙酯具有酒香味，苯甲酸乙酯具有濃烈的蜂蜜香味，己酸乙酯具有果香味［11］。酯類物質主要來源于在微生物的作用下，酸類物質和醇類物質之間進行的酯化反應。乙酸芳樟酯在4種川味香腸中含量皆為最高，在智能化控溫控濕且接種混合發酵劑生產的低酸川味香腸中己酸乙酯和辛酸乙酯的含量也較為豐富，這2種物質都對低酸度川味香腸的風味形成起到重要作用。A組香腸中酯類物質的相對含量為22.16%，明顯高于B組、C組和D組的13.67%、13.21%和16.91%。，這與王海燕研究的法式發酵香腸的接種發酵劑的42.10%和自然發酵的25.32%的相似［12］。

就醛類物質而言，它具有較低的閾值［13］，因此對發酵香腸風味形成的貢獻很大。低級醛具有特殊的氣味，通常C3和C4醛具有強烈的刺激性氣味;C5～C9醛具有油蠟和油膩味;C10～C12醛具有檸檬味和橘皮味［14］。A組(低酸度川味香腸)中的種類數量最多。A組香腸中醛類物質相對含量為14.26%，明顯高于B組、C組和 D組的11.68%、10.51%和10.45%。己醛具有清香和草香氣味，是ω-6不飽和脂肪酸的主要講解產物［15］，它既可來源于酯化的亞油酸，又可來源于游離的亞油酸。A組香腸中相對含量較高的個體風味成分主要有己醛和壬醛，己醛的含量在4種川味香腸最終最高，高含量的己醛可以明顯的改善香腸風味，這與Forss等人的研究結果相似［16-17］。4種川味香腸中均檢測到了苯甲醛，該物質具有苦杏仁味，對川味香腸風味的形成具有重要作用。Casaburi［18］等研究發現游離脂肪酸是揮發性風味成分的主要前提物質，由于乳酸菌對脂肪的分解作用，使得醛類物質大量存在于川味香腸中。

就酮類物質而言，它一般由美拉德反應生成，也可能是脂肪的氧化、降解反應等生成［19］。酮類揮發性成分一般呈奶油味或者果香味，是香氣的重要組成成分，它可以是醇的氧化產物也可以是酯類分解產物，酮類物質的閾值很低對發酵肉制品的風味有重要重要作用［20］。在4種川味香腸中，A組酮類物質的相對含量為 2.51%，高于 B組、C組和 D組的1.61%、1.74和 1.57%，這與許慧卿［21］等研究接種米酒乳桿菌對發酵香腸揮發性物質的影響結果相似。

就脂肪烴類物質而言，A組和C組川味香腸中的種類數較為豐富，分別為26種和23種。脂肪烴類物質主要包括烷烴、烯烴和芳香烴，一般認為烴類物質呈味閾值較高，對風味貢獻不大［22］。β-石竹烯為脂肪烴類的代表成分，為4種川味香腸的共有物質，它屬于萜類物質，其來源于添加的胡椒粉，具有很強的辛辣風味。苯乙烯在A組香腸和C組香腸中被檢測出，相對含量分別為0.23%和0.21%，這種物質對改善香腸風味具有一定作用。4種川味香腸中脂肪烴類物質的差異主要體現在3-蒈烯、羅勒烯和γ-欖香烯這3種成分上。其中，γ-欖香烯是低酸度川味香腸特有的成分。此外，在4種川味香腸中，相對含量較高的物質還有檸檬烯、β-月桂烯，其均屬于萜類物質。

就酸類物質而言，4種川味香腸中，乙酸的相對含量均為最高，微生物對碳水化合物的代謝產生乙酸，植物乳桿菌和戊糖片球菌都是常用的發酵香腸的發酵劑，一般活性較高;此外，除過微生物發酵途徑，氨基酸與脂肪代謝也會產生乙酸，固有大量乙酸積累［23］。A組和C組川味中乙酸相對含量明顯高于B組和D組，這是由于A組和C組川味香腸中接種了乳酸菌，微生物發酵的結果，而A組香腸中乙酸的相對含量為1.35%，其明顯高于C組的0.33%，這是因為A組接種的乳酸菌在較適宜的溫度和相對濕度下生長，微生物代謝旺盛，而C組接種的乳酸菌在較低的環境溫度下，生長緩慢，代謝較慢所致。此外，A組(低酸度川味香腸)中還檢測到了己酸、乙二酸和甲氧基乙酸，己酸的生成可能是由于乙醇含量較高，其與丁酸反應，最終丁酸全部轉換成了己酸，其中間產物丁酸也是一種重要的揮發性物質，對川味香腸風味的形成具有重要的作用;己酸會進一步反應生成己酸乙酯［24］，因此A組(低酸度川味香腸)中己酸乙酯和己酸的含量均較高。酸類物質在發酵香腸中是非常重要的風味物質，它可以促使香腸復雜風味的形成，使發酵香腸形成其獨特的發酵風味，同時它是酯類生成的中間物質。

雜環類化合物主要來源于還原糖與氨基酸發生的美拉德反應產物，其具有較低的閾值，是發酵香腸重要的呈味物質［25］。2-戊基呋喃在4種川味香腸中均被檢測到，分別為 0.63%、0.36%、0.75%和0.47%，其相對含量較少，它被認為是亞油酸的一種氧化產物，具有類似火腿的香味［26］，對改善香腸風味具有一定作用。

3 結論

通過HS-SPME結合GC-MS可以較好的分析4種不同加工條件下生產的川味香腸的揮發性成分，其中脂肪烴類、酯類和醇類物質是主要的揮發性風味物質。其中A組(低酸度川味香腸)中酯類、酸類和脂肪烴類物質的種類數較多，而酯類、醇類、和醛類物質的相對含量分別為22.16%、21.29%和14.26%，均顯著高于B組、C組和D組。就個體風味成分而言，4種川味香腸中芳樟醇、己醛和乙酸芳樟酯的相對含量均較高，除此之外，每種川味香腸中其它相對含量較高的風味成分在種類和數量上均存在較大差異。A組(低酸度川味香腸)中乙酸相對含量明顯高于其它組，此外，乙二酸、甲氧基乙酸和己酸均在低酸度川味香腸中檢測到。4種川味香腸的揮發性成分主要來自于脂肪的降解氧化、碳水化合物和蛋白質在加工過程中的生化反應及香辛料和發酵劑的作用。

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