黃樟素類化合物分析檢測研究進展

李葉青，皮小弟，許洪勇，成 蓮，曾石峭

(1.廣東省河源市質量計量監督檢測所，廣東河源 517000;2.廣東省河源市食品藥品監督檢測所，廣東河源 517000)

黃樟素(safrole)(CAS:94-59-7)又稱黃樟油素、黃樟腦，無色或微黃色液體，不溶于水，易溶于氯仿，乙醚和其他非極性有機溶劑［1－2］，有樟木氣味，天然存在于肉桂、肉豆蔻、黑胡椒和紫蘇等植物中，是許多食用天然精油如黃樟精油、八角精油和樟腦油的主要成分。由于其舒適的氣味，黃樟油曾經在食品、洗滌用品和化妝品中作為調味劑和調香劑［3］。

黃樟素類化合物主要包括黃樟素、異黃樟素和二氫黃樟素等。黃樟素用來合成胡椒基丁醚和胡椒醛，胡椒基丁醚是農藥的增效劑，胡椒醛用來調味，是香料的組分［4－5］。黃樟素也是非法生產毒品——搖頭丸的一個重要組成部分［6］。異黃樟素和二氫黃樟素是黃樟素的衍生物，異黃樟素是黃樟素在氫氧化鉀－無水乙醇溶液中加熱異構化的產物，有類似茉莉醛的氣息，香氣強烈而持久;二氫黃樟素由黃樟素氫化而得，是合成農藥增效醚的重要中間體，具有黃樟素類似的香氣。

許多常見的香料，包括黑胡椒、可可、肉豆蔻、肉桂、龍蒿、八角、茴香、香菜、西芹、月桂、小茴香、香果和丁香都含有微量的黃樟素［7－8］。使用上述香料的軟飲料中黃樟素的檢出限為3～5 mg/L，可口可樂和百事可樂也包含其中［9］;酒精飲料含有0.15 ～3.00 mg/L［10］。

試驗表明，黃樟素對老鼠有致肝腫瘤的效果。1960年12月3日，美國食品藥品監督管理局(FDA)禁止食品中有黃樟素、黃樟油、異黃樟素和二氫黃樟素的存在［11］。2001年，歐盟委員會規定黃樟素和異黃樟素的總使用限量，食品和飲料中為1 mg/kg，含酒精飲料為5 mg/kg(酒精含量大于25%);含肉豆蔻食品為 15 mg/kg［3，12－13］。2005 年，歐洲委員會將黃樟素列為懷疑弱致癌物質，雖然沒有規定每日限量，但要求設置的盡可能低，目前正在由歐洲委員會評估［14］。黃樟素的允許攝入量，歐盟委員會估計為0.3 mg/d，或成人以60 kg體重計0.005 mg/kg［12］;世界衛生組織估計美國人為 4 ～569 μg/d，歐洲人0.6 ～879.0 μg/d［15］。黃樟素 TD50為51 mg/kg［16］。

我國于2005年實施的《易制毒化學品管理條例》將黃樟素列為第一類易制毒化學品。由于黃樟素類化合物的毒副作用，建立準確、快速、簡便的黃樟素類化合物分析檢測方法，對于評估食品、化妝品及煙草的安全性有著重要作用。目前，常用檢測方法有高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜－串聯質譜法(LC-MS/MS)、氣相色譜法(GC)和氣相色譜－質譜聯用法(GC-MS)等，筆者簡要概括了近年來國內外文獻報道的黃樟素類化合物分析檢測方法。

1 氣相色譜與氣相色譜質譜聯用法

直接用氣相色譜－火焰離子化檢測器(GC-FID)定量或用氣相色譜－質譜聯用法(GC-MS)定性定量檢測是目前測定黃樟素類化合物的主要方法。

2001年，Choong等采用GC-FID分析了軟飲料中的黃樟素和異黃樟素［9］。樣品未經處理直接進樣，以1，4-二羥基苯(DHB)為內標定量，檢出限為0.25 μg/ml。分析的25種軟飲料中有20種檢出目標物。

吳婷等為了同時分析吐司面包、番茄醬、廣式香腸、可樂、葡萄酒中的黃樟素等多種成分，采用同時蒸餾萃取方法以二氯甲烷為提取劑將待測物從食品基質中分離出來，用1，4-二溴苯和乙酸苯乙酯為內標定量［17］。GC-FID測定黃樟素的方法檢出限為0.2 μg/ml。待測物與內標物峰面積比值與濃度比值呈現良好線性關系，相關系數為0.999 54～0.999 73，空白加標回收率為 82.147% ～98.106%，相對標準偏差(RSD)為1.109% ～4.105%，通過對市場上5種食品的檢測，表明該法可實現對樣品進行靈敏、準確的定性定量分析。

王星等建立用氣相色譜－質譜聯用法測定化妝品中黃樟素、6-甲基香豆素的方法［18］。方法樣品用甲醇提取，超聲后定容，脫水，經0.45 μm 濾膜過濾，用GC-MS法定性，外標法定量。該方法條件下，黃樟素的加標回收率為101.3%～106.0%，RSD 為0.9% ～1.4%，測定限(以S/N=10 計)為 5 μg/g。

周貽兵等將煙用香精樣品以甲醇超聲提取，提取液經高速離心、0.45 μm 濾膜過濾后，供氣相色譜測定［19］。采用SE-54毛細管柱分離樣品，經FID檢測，外標法定量。黃樟素的質量濃度在1.0～50.0 mg/L范圍內與其色譜峰面積呈線性關系，方法的檢出限(3S/N)為0.3 mg/L。黃樟素加標回收率在88.0% ～94.7%，RSD(n=6)在 0.8% ～4.5%。

李長于等采用乙醇超聲提取，丙酸苯乙酯為內標進行定量，氣相色譜－離子阱串聯質譜法測定香精香料中黃樟素的含量［20］。選取黃樟素的母離子和子離子分別為m/z 162和m/z 131，內標丙酸苯乙酯選擇m/z 104為定量離子。結果表明，黃樟素在0.05～5.00 mg/L范圍內呈良好線性關系(r＞0.995)，方法的檢測限(S/N=3)黃樟素為 0.002 mg/L，加標回收率為90.0% ～131.2%。

MAHESH·PAL等將肉豆蔻果實通過水蒸氣蒸餾得到的揮發油通過GC和GC-MS進行分析［21］。代表該精油的95.9%的28種成分被確認:黃樟素含量為3.4%。

Queila P.S.Barbosa等對一種胡椒科植物的黃樟素含量通過GC-MS和GC-FID進行分析［22］。該組織葉、果實、莖的黃樟素含量分別為2.0%、4.8%和1.7%。GC檢測條件為:DB-5 石英毛細管柱(30 m ×0.25 mm i.d.×0.25 μm)，起始柱溫60℃，3℃/min升到240℃。

2 液相色譜與液相色譜質譜聯用法

近年來，由于帶有二極管陣列檢測器(DAD)的液相色譜儀具有的定性定量檢測的能力，使用DAD-LC檢測黃樟素含量的報道較多，而LC-MS/MS比普通的LC有更高的分析選擇性和靈敏度，越來越多的研究采用LC-MS/MS來分析復雜食品基體中的黃樟素。

王海利等建立了利用超高效液相色譜儀檢測天然提取物中黃樟素含量的方法［23］。以無水乙醇為溶劑，振蕩萃取黃樟素后，直接進樣。經配置FLRD檢測器的超高效液相色譜于激發波長288 nm、發射波長325 nm下對其進行檢測。所得回歸方程為:Y=5.51×106X+3.48×105，(R2=0.998 6，n=5)，平均回收率為95.1%，檢測限為 38.3 ng/g。

Kurt A.Reynertson等建立了高效液相色譜定量檢測一種香樟樹皮中黃樟素的方法［24］，235 nm PDA檢測，黃樟素標準物出峰時間約在20 min，回歸曲線R2=0.999 9。該植物材料的甲醇提取物中黃樟素的含量為0.435%(W/W)(±5×10－6)，方法檢測限定量限分別為1.25 μg/ml和3.75 μg/ml。

Chu Chen等建立了高效液相色譜法測定某些藥材中的黃樟素和甲基丁香酚的含量［25］，Nucleosil 100-5 C18色譜柱(5 μm，250 mm ×4.0 mm i.d.)，外加保護柱(5 μm，8 mm ×4.0 mm i.d.);流動相為甲醇、四氫呋喃和水(52∶8∶40);流速為1.0 ml/min;檢測波長為286 nm。分析表明，黃樟素在測試的干草藥的含量范圍為0.14～2.78 mg/g。

Kate Cummings建立了超快速液相色譜(UFLC)檢測黃樟素的方法［26］。色譜條件為:YMC ODS-AQ S-8反相C18色譜柱(5 μm，250 mm ×4.6 mm i.d.);流動相:(溶劑 A)蒸餾水，(溶劑B)乙腈。HPLC的條件如下:0～5 min(B)5%，5～10 min(B)15%，10～45 min(B)100%，保留10 min;進樣量為10 μl;235 nmUV檢測。黃樟素保留時間為(37.77±0.23)min，LOD 和LOQ 分別為1.514 mg/kg 和2.049 mg/kg。

3 我國現行檢測分析標準

近年來，我國相繼制定了一系列黃樟素的分析檢測國家標準、行業標準或法規。標準方法中氣相色譜是主要的檢測手段。GB/T 14454.15－2008《黃樟油 黃樟素和異黃樟素含量的測定填充柱氣相色譜法》以癸酸乙酯為內標，以GC-FID分析黃樟油中黃樟素和異黃樟素。SN/T 1783－2006《進出口化妝品中黃樟素和6-甲基香豆素的測定氣相色譜法》中方法——采用甲醇超聲提取化妝品中的黃樟素和6-甲基香豆素，GC-FID測定并以GC/MS確證。

4 結語

綜上所述，黃樟素檢測方法的研究開展的不算晚，主要集中在香精、香料及煙草中的研究。測定黃樟素類化合物的國家標準或法規還不多，并且這些標準或法規中多數只規定了1～2種物質的分析方法，相關文獻報道的檢測方法也大多是檢測1～2種黃樟素類物質，而隨著其他化合物的毒理學信息的報道及添加限量的控制，同時檢測多種黃樟素類物質及其他化合物的分析標準可能將是今后制定標準的方向。

食品中黃樟素類化合物的檢測還未見有標準方法的建立，目前，僅有試驗研究報道采用液相萃取與色譜分離結合的方法分析食品中的黃樟素。黃樟素類化合物可用作天然除蟲菊酯農藥增效劑，隨著除蟲菊酯類農藥的大量使用，必將造成它在食品特別是茶葉中的殘留;黃樟素也曾是很多食品的添加劑，如用于飲料，但因其對人毒害較大，已禁止作為食品添加劑使用。食品中禁用物質的檢測，準確定性至關重要，新技術、新方法的研究仍十分重要，相信食品中黃樟素類化合物的分析檢測必將朝著準確化、快速化及多元化的方向發展。

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