兔脊髓缺血再灌注損傷后能量代謝與NF-κ Bp65表達變化*

章建平方 華張競超章放香

兔脊髓缺血再灌注損傷后能量代謝與NF-κ Bp65表達變化*

章建平①方 華①張競超①章放香①

目的：探討脊髓缺血再灌注損傷（SCIRI）中能量代謝與NF-κBp65的變化規律。方法：40只新西蘭大白兔采用腎下腹主動脈阻斷45 min，建立脊髓缺血再灌注損傷模型。分別于缺血前、缺血45 min及再灌注30、60、120 min時取脊髓測定腺苷酸（ADP、AMP、ATP）、活性氧（ROS）、核轉錄因子-κBp65（NF-κBp65）、抑制蛋白-κBα（I-κBα）和細胞間黏附分子-1（ICAM-1）蛋白表達變化。結果：與缺血前比較，缺血45 min及再灌注30、60、120 min時脊髓腺苷酸及I-κBα均降低（P＜0.01），ROS、NF-κBp65和ICAM-1均升高（P＜0.01）。結論：SCIRI中ICAM-1和NF-κBp65表達上調加重脊髓能量代謝障礙。

脊髓缺血再灌注損傷； 能量代謝； NF-κBp65

脊髓缺血再灌注損傷（spinal cord ischemiareperfusion injury， SCIRI）中脊髓神經細胞能量代謝異常將影響術后脊髓功能恢復[1-3]。研究證實，炎性反應是引起SCIRI的主要機制之一[4-5]。本研究通過觀察SCIRI中脊髓腺苷酸代謝的變化來探討抑制蛋白-κBα（inhibitor-kappa Bα，I-κBα）、核轉錄因子-κBp65 （nuclear factor-kappa Bp65，NF-κBp65）和細胞間粘附分子（intercellular adhesion molecule， ICAM-1）調控炎性信號轉導在脊髓能量代謝障礙中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 鼠抗兔ICAM-1、I-κBα及NF-κBp65多克隆抗體（均為Sigma公司）；單磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）標準品（美國Sigma公司）；鏈霉親和素-生物素復合物（strept avidin-biotin complex，SABC）試劑盒及活性氧（reactive oxygen species，ROS）試劑盒（均為中國上海研吉生物科技有限公司）。

1.2 動物模型的建立 40只健康新西蘭大白兔 （貴陽醫學院實驗動物中心提供），雌雄不限，體重2～2.5 kg。采用左腎動脈下方腹主動脈夾閉法建立SCIRI模型。阻斷45 min后松鉗開放腹主動脈，恢復脊髓血液灌注，以造成腰段脊髓再灌注損傷。術中以生理鹽水浸潤的溫紗墊覆蓋腹腔臟器，直腸溫度維持于36～37 ℃。

1.3 評價方法 分別于缺血前、缺血45 min及再灌注30、60、120 min時間點取脊髓L3～L4節段脊髓組織，其中一部分脊髓組織加入4 ℃生理鹽水超聲勻漿及3500 r/min離心5 min后取上清液置于-80 ℃冰箱凍存，備測脊髓組織ROS活力變化。另一部分脊髓組織固定于10％福爾馬林中，作為脊髓組織免疫組織化學檢測。按照試劑盒說明書催化L-Arg氧反應法測定ROS活力以及SABC免疫組織化學法測定ICAM-1表達、I-κBα和NF-κBp65的表達及核移位，使用Olympus BX51圖像采集分析系統等距隨機抽樣攝片并定量分析各時間點ICAM-1、I-κBα和NF-κBp65細胞核陽性表達率和胞核平均灰度值，計算陽性細胞平均百分率，作為此片的陽性細胞計數。

1.4 統計學處理 采用SPSS 16.0軟件統計處理，計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析和q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 脊髓組織ATP、ADP和AMP含量的比較 缺血45 min及再灌注30、60、120 min時ATP、ADP和AMP均明顯降低，ROS活力顯著升高，與缺血前比較差異均有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 ATP、ADP和AMP含量的變化（±s）

表1 ATP、ADP和AMP含量的變化（±s）

*與缺血前比較，P＜0.01

ROS（U/mL）缺血前（n=40）5.8±0.64.9±0.82.7±0.41.3±0.4缺血45 min（n=40） 1.7±0.3*2.2±0.3*1.5±0.6*10.6±1.8*再灌注30 min（n=40） 2.2±0.5*2.9±0.7*1.1±0.3*20.5±4.1*再灌注60 min（n=40） 3.6±0.9*3.3±0.5*1.8±0.2*27.2±4.9*再灌注120 min（n=40） 3.3±0.4*2.7±0.4*1.3±0.5*25.6±5.5*時間ATP（μmol/g）ADP（μmol/g）AMP（μmol/g）

2.2 脊髓組織NF-κBp65、I-κBα和ICAM-1表達的比較 缺血45 min及再灌注30、60、120 min時間時I-κBα表達均明顯下降，NF-κBp65及ICAM-1表達顯著上升，與缺血前比較差異均有統計學意義（P＜0.01），見表2。

表2 脊髓NF-κ Bp65、I-κ Bα和ICAM-1表達變化（±s）

表2 脊髓NF-κ Bp65、I-κ Bα和ICAM-1表達變化（±s）

*與缺血前比較，P＜0.01

時間NF-κBp65I-κBαICAM-1平均灰度值陽性細胞百分率 （％）平均灰度值 陽性細胞百分率（％）平均灰度值陽性面積百分率（％）缺血前（n=40）44.3±10.18.5±1.9188.6±13.285.3±10.10.0±0.00.0±0.0缺血45 min（n=40）175.8±18.6*68.3±7.2*79.4±9.4*34.5±6.7*126.2±19.3*65.4±8.7*再灌注30 min（n=40）190.4±21.1*69.6±8.4*61.6±9.5*26.2±5.9*146.6±22.7*70.1±10.4*再灌注60 min（n=40）197.3±18.9*84.5±7.6*32.1±8.5*13.7±4.6*180.3±20.4*74.3±9.4*再灌注120 min（n=40）183.5±16.1*77.4±9.3*31.8±6.6*11.4±5.3*183.9±22.1*76.2±9.6*

3 討論

SCIRI期間脊髓神經功能的維持依賴于充足的ATP合成與代謝，脊髓神經細胞能量代謝障礙不僅參與脊髓神經功能不全的發生， 而且是術后截癱發生率上升的主要因素[6-8]。本研究發現，缺血后脊髓組織ROS活力顯著升高，與此同時，缺血脊髓組織ATP、ADP和AMP水平下降，提示脊髓缺血后神經細胞線粒體損傷引起ATP、ADP和AMP合成與代謝異常，而再灌注后雖然脊髓組織的血供得到恢復，但SCIRI期間大量釋放的ROS炎性介質進一步損害脊髓神經細胞能量轉移與利用，說明脊髓缺血可引起脊髓神經細胞線粒體合成ATP、ADP和AMP能力受限，而再灌注時ROS炎性介質可加重損害脊髓神經細胞能量代謝，造成脊髓神經細胞能量代謝障礙。

本研究觀察到脊髓缺血后脊髓組織I-κBα蛋白表達逐漸降低，而NF-κBp65核移位和ICAM-1蛋白表達逐漸升高且出現脊髓神經細胞能量代謝障礙，說明SCIRI期間脊髓組織NF-κBp65/I-κBα炎性信號轉導系統啟動，通過上調脊髓組織ICAM-1表達引起脊髓組織炎性反應，進而損害脊髓神經細胞能量轉移與利用。研究證實ROS是白細胞活化過程中脂質過氧化反應的炎性介質之一[9-13]，ROS可誘導I-κBα蛋白水解磷酸化啟動NF-κBp65/I-κBα炎性信號轉導系統[14]。本研究中，SCIRI脊髓神經細胞能量代謝障礙中ROS活力升高的同時ICAM-1及NF-κBp65蛋白表達也明顯升高，說明NF-κBp65/I-κBα炎性信號啟動可能是引起脊髓神經細胞能量代謝障礙的發生機制之一。

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Changes of Energy Metabolism and the Expression of NF-κ Bp65 after Spinal Cord Ischemia-Reperfusion Injury in Rabbits

ZHANG J ian-ping，FANG Hua，ZHANG J ing-chao，et al.//Medical Innovation of China，2015，12（09）：024-026

Objective：To assess the changes of energy metabolism and NF-κBp65 during spinal cord ischemia and reperfusion injury（SCIRI）. Method：The SCIRI model was made by clamping the infrarenal aortic for 45 minutes in 40 rabbits.Reactive oxygen species（ROS），the expression of nuclear factor-kappa Bp65（NF-κBp65），inhibitor-Kappa Bα（I-κBα）， intercellular adhesion molecule（ICAM-1） and the content of adenine nucleotide（ADP，AMP and ATP） in spinal cord tissue were determined before ischemia，45 minutes after ischemia，30，60 minutes and 120 minutes after reperfusion. Result： The spinal cord content of adenine nucleotide and I-κBα decreased while ROS，the expressions of NF-κBp65and ICAM-1 increased at 45 minutes after ischemia，30，60 minutes and 120 minutes after reperfusion as compared to the value before ischemia （P＜0.01）. Conclusion：The upregulation of the expression of ICAM-1 and NF-κBp65 aggravates the energy metabolism disorder of spinal cord during SCIRI.

Spinal cord ischemia-reperfusion injury； Energy metabolism； NF-κBp65

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.09.008

2014-09-29） （本文編輯：蔡元元）

貴州省衛生廳基金資助項目（gzwkj2010-1-006）；貴州省科技廳基金資助項目（黔科合SY字[2011]008號）；貴州省科技廳基金資助項目（黔科SY字[2012]3090號）；貴州省科技廳基金資助項目（黔科SY字[2012]001號）

①貴州省人民醫院 貴州 貴陽 550002

方華

First-author’s address：Guizhou Provincial People’s Hospital， Guiyang 550002，China