多重PCR技術在植物生物學研究中的應用進展

任素賢，艾鵬飛，宋層孝，陳文靜，宋建軍(河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊050018)

聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)是體外酶促合成反應、重復擴增DNA序列的一種方法，可以使目標DNA片段在幾個小時內擴增出千萬倍。自1983年PCR技術建立以來，由于其超強的擴增能力，且可與其他分子生物學方法相結合，已廣泛應用于生命科學的各個領域，成為發展和應用最為迅猛的分子生物學技術之一。隨著該技術的不斷發展和創新，目前已開發出了一系列適用于不同研究目的的PCR新技術，如反轉錄PCR、熒光實時定量PCR、差異顯示PCR、著色互補PCR、巢式PCR、免疫PCR、多重PCR等［1－3］。

多重PCR(Multiplex－PCR)技術因為具有高效快捷、高度特異敏感、實驗成本低、實驗進程快等優點而得到廣泛應用。自1988年Chamberian等［4］首先報道了用多重PCR診斷杜式肌營養不良癥(DMD)以來，多重PCR技術迅速在動物、微生物以及人類研究方面得到廣泛應用［5－6］。然而，多重PCR技術在植物生物學研究方面起步較晚，研究與應用相對較少［7］。目前，隨著對多重PCR技術認識的加深和研究的深入，越來越多的植物學家們熱衷于研究多重PCR技術在植物生物學中的應用。

1 多重PCR技術的原理和發展

1.1 多重PCR技術的原理 多重PCR(multiplex PCR)是在普通PCR的基礎上發展起來的，其原理與常規PCR基本相同，即它是在同一個PCR反應體系中加入2對或2對以上的特異性引物，由于各引物都能與模板DNA特異性結合，因而可同時擴增出針對多個DNA模板或同一模板不同區的多個目的DNA片段［8－10］，該方法可節省時間、降低成本、提高效率、加快試驗進程。該技術基于引物篩選的基礎上，需要對反應體系和反應條件進行多次優化。

1.2 多重PCR技術的發展 近年來，隨著分子生物學的迅猛發展和新技術的不斷涌現，基于傳統的多重PCR原理已開發出一系列的新技術，如多重PCR生物芯片技術、雙寡聚核苷酸引物多重PCR技術、AFLP多重PCR、逆轉錄多重PCR、巢式多重PCR、實時多重PCR技術、熒光定量多重PCR等，以滿足實踐中不同研究和應用的需求［11］。目前，基于多重PCR試劑盒的研發也取得了一些進展，如QIAGEN公司研制出的一種新型多重PCR反應緩沖系統，通過添加來調節平衡K+，以擴大多重PCR反應的最適退火溫度范圍;BioSource研制出的多重PCR試劑盒，可以直接用于目標基因的檢測和分析［12］。

2 多重PCR技術在植物生物學研究中的應用

2.1 植物種質純度和屬性鑒定 多重PCR技術已成為植物種質純度鑒定、血統歸屬辨別方面的一種高效、快捷的手段。在大田作物種質純度鑒定方面，Arlorio等［13］應用多重PCR將硬粒小麥和普通小麥區分開，且是基于內轉錄間隔區(ITS)的擴增，所以在高溫下也能有效工作。萬映秀等［14］建立了3個多重PCR體系并應用到141份國內外小麥品種的檢測中，其結果與SDS-PAGE結果相比較，這3個多重PCR體系能夠準確高效地檢測9個小麥品質性狀的基因組成。譚君等［15］以3個玉米自交系、4個玉米雜交種為試驗材料，建立了7對SSR引物的多重PCR體系，對玉米雜交種和自交種進行鑒定，結果在準確可靠性上優于單一引物PCR，充分顯示出多重PCR高效快捷、成本低廉的優點。陳浩東等［16］利用雙重PCR檢測體系對雜交棉種子純度進行了鑒定，對親緣關系較近的品種間混雜進行了三重、四重PCR擴增，也得到了正常的擴增結果，為進一步簡化棉花SSR多重PCR程序及優化處理提供了有益參考。在園藝植物種質鑒別方面，Polashock等［17］利用多重PCR技術快速地鑒別出不同基因型的美洲漿果;Li等［18］基于多重PCR分子檢測，鑒別出釀造葡萄酒和蘋果汁所用的果品種類。在植物血統歸屬方面，可以根據植物不同種質的生物學特性，利用多重PCR進行鑒別，如Pastorino等［19］采用多重PCR技術對不同種屬大豆的根瘤菌進行擴增，基于擴增出不同大小的基因片段長度將其血統歸屬辨別開來，結果擴增出的730 bp基因片段與我國血統的大豆根瘤菌的寄主品種特異基因同源，900 bp的基因片段與日本大豆根瘤菌的寄主品種的特異基因同源，故此較好地辨別出中國大豆和日本大豆。

2.2 轉基因植物鑒定 目前，多重PCR技術已成功應用于轉基因和非轉基因植物的鑒別實踐中［20］。2002年，Permingeat等［21］基于2對引物的PCR技術同時檢測CryIA基因和PAT基因，成功地將轉基因玉米與非轉基因玉米區分開來。2005年，邵碧英等［22］提取玉米及其制品的總DNA，用PCR方法檢測其中的轉基因成分并篩選陽性樣品，建立幾組玉米內源zein基因和轉基因成分之間的多重PCR檢測方法，結果表明，所建立的多重PCR方法應用于同時檢測玉米內源基因和轉基因成分是可行的。2006年，邵碧英等［23］建立的馬鈴薯內源PATA基因和3種轉基因成分之間的多重PCR檢測體系，能夠特異地應用于馬鈴薯及其制品中轉基因成分的檢測。2009年，王渭霞等［24］利用四重PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳，能夠快速準確地檢測出目前為止轉基因水稻中常用的 CaMV35S、NOS、Bt、CpTi等外源基因。2011年，陳貞等［25］建立棉花轉基因成分六重PCR檢測體系，以棉花內源基因sad1、報告基因GUS、外源抗蟲基因Cry1Ab/Ac、篩選基因NPTⅡ、NOS終止子和CaMV35S啟動子為檢測目標，結果表明該多重PCR檢測體系能夠有效地從少至1顆棉籽的少量樣品中檢測出其中的轉基因成分。2013年，邱良焱等［26］以轉Bar、Bt基因的雙抗稻米為試驗原料，針對其水稻內源基因SPS和外源基因設計多重PCR檢測體系，成功地應用該檢測體系快速地檢測出原料中的全部6條目標基因。

2.3 植物病害檢測 多重PCR在生物體疾病診斷或檢測上的應用是從人類開始的，所以在人類和動物上有著非常廣泛的應用，并取得了巨大的成就。相比之下，多重PCR在植物病蟲害檢測上的應用研究較少。2001年，Fraaije等［27］利用多重PCR一次性辨別出小麥的葉斑病、條銹病、黃銹病和褐銹病這4種病原體，然后提取出來并按量接種到19個小麥品種上，結果表明，大多數冬小麥品種的表現性狀與其接種量成正比，這為其他大樣本病害的早期檢測和防治提供了有益的參考。2002年，Dovas等［28］對感染黃化病的馬鈴薯植株進行取樣分析時發現，馬鈴薯同時被2種病毒(TICV和ToCV)侵染，由于這2種病毒擴增出的片段分別是229和466 bp，所以他們運用多重PCR對樣品進行分析，能快速、準確地將其鑒別出來。2008年，岳紅妮等［29］通過多次優化建立起可同時檢測大麥條紋花葉病毒、大麥黃矮病毒PAV株系、小麥黃花葉病毒和小麥藍矮植原體的多重PCR檢測體系，被這4種病毒復合侵染的小麥多重PCR擴增后出現了503、600、898和1 240 bp的4條特異性帶，實現了植原體DNA病原和病毒RNA病原的同時檢測，體現出多重PCR的優越性。張顯勇等［30］也建立了可以同時檢測甘蔗花葉病和宿根矮化病的多重PCR檢測體系，能夠穩定且特異地檢測出蔗株中是否有導致甘蔗花葉病和宿根矮化病的單一或混合的病原。2010年，譚小勇等［31］建立的三重PCR體系擴增出615、480和945 bp的特異片段可同時用來檢測香蕉束頂病毒﹑黃瓜花葉病毒和香蕉線條病毒，進一步利用該三重PCR技術初步檢測49份采自華南地區不同蕉區的田間樣品，結果表明該多重PCR體系可以有效地檢測上述3種病毒。2011年，趙芹等［32］根據小西葫蘆黃花葉病毒、番木瓜環斑病毒和黃瓜花葉病毒的外殼蛋白基因保守區序列設計了特異引物，在單一PCR的基礎上經過優化，初步建立了能同時檢測以上3種病毒的多重PCR檢測體系，為節瓜病毒病原的檢測提供了理論與技術支持。

2.4 植物的抗病基因檢測 近年來，利用多重PCR技術同時檢測2種以上抗病基因的研究越來越受到人們的重視。2005年，李君明等［33］利用多重PCR反應體系，分別對番茄抗根結線蟲的Mi基因、抗番茄花葉病毒病的Tm－22基因緊密連鎖的SCAR標記進行了同時擴增篩選，擴增的特異性片段與單引物擴增片段基本完全吻合，再進行酶切以鑒別雜純合基因型和感病基因型，該體系可用于在同一PCR反應體系中，對2個抗病基因進行同時篩選鑒定及苗期早期輔助選育。2008年，倪大虎等［34］利用多重PCR技術，可以在同一PCR反應體系中同時選擇Pi9(t)基因和Xa21基因，與分別的單一PCR檢測結果完全一致，提高了PCR的選擇效率。2011年，研究者［35］建立了可同時檢測抗馬鈴薯胞囊線蟲H1基因，抗馬鈴薯X病毒RX1基因，抗馬鈴薯晚疫病R1、R2基因和抗馬鈴薯Y病毒Rychc基因的多重PCR檢測體系，并利用此體系檢測含有這5種抗病基因的96株雜交植株時，結果準確、可靠，且用時比單一PCR少得多。2012年，陳濤等［36］利用與抗白粉病基因Pm21和Pm13連鎖的特異標記，隨機挑選出114株含有抗白粉病基因Pm21和Pm13的雜交F4代群體進行單一PCR和多重PCR檢測，其中5株具有Pm21的特異標記，4株具有Pm13的特異標記，還有4個單株同時具有Pm21和Pm13的特異標記，多重PCR與單一PCR檢測結果一致。這說明該體系可以應用于對Pm21和Pm13的多重PCR檢測，能夠更加快速地檢測出含有這2個抗病基因的累加體材料。2013年，劉超勤等［37］只利用一次多重PCR反應同時對番茄抗黃化曲葉病毒病的Ty-1、Ty-2基因，抗根結線蟲病Mi基因和抗葉霉病Cf-5基因緊密連鎖的CAPS標記進行了篩選，經酶切后所獲得的特異性片段大小與前人試驗所得大小基本相同，證明了四重PCR檢測的準確性。

2.5 在植物育種上的應用 近年來，育種學家們也把多重PCR技術運用到多種植物育種過程中。2003年，研究者［38］運用多重PCR技術分析澳大利亞主要的50個小麥栽培種的高分子量麥谷蛋白亞基，結果顯示僅有2個品種的高分子量麥谷蛋白亞基與前人測定的不同，隨后也證實了是前人檢測有誤。該體系中所使用的3個引物對都處于小麥不同的染色體組，這能同時鑒定出所有的高分子量麥谷蛋白亞基。2003年，張樹珍等［39］以PchsA為啟動子構建了康乃馨ACC氧化酶基因的反義植物表達載體，通過農桿菌介導法把這個載體導入康乃馨優良的栽培品種中，獲得3株轉基因植株，經多重PCR和PCR-Southern雜交檢測，證實康乃馨ACC氧化酶的反義基因已經整合到康乃馨的基因組中，獲得了能延長插瓶壽命的康乃馨新品種。2007年，張曉科等［40］利用現有小麥品質性狀基因的分子標記，建立了3個多重PCR體系，并用已知性狀的品種進行了驗證。其中，多重PCR體系Ⅰ可用于一般的小麥品質分子育種，以提高選育材料的整體加工品質水平;體系Ⅱ可用于強筋小麥品種的選育;體系Ⅲ可用于淀粉品質或糯小麥的選育。由于每個體系中的引物之間不存在相互抑制和錯配，因此品種檢測的結果可靠、重復性好、成本低。將這3個多重PCR檢測體系用于小麥品質育種的親本評價和雜交后代優質基因的聚合，有助于提高優質專用小麥品種評價和選育的效率。2009年，鄭寒等［41］基于小麥Ax1/Ax2、Dx5和Bx7OE等優質亞基的特異性分子標記構建相應的多重PCR體系，經過品種和群體檢驗，利用該體系鑒定這些亞基的結果穩定可靠、成本低。進一步利用該技術對89份西藏小麥育成和推廣品種(系)的優質亞基頻率進行鑒定，結果顯示，該區小麥沒有檢測到Bx7OE，同時攜帶2個優質亞基的材料頻率約為10%。這說明，多重PCR可作為一種可靠性高、實用性強的標記輔助選擇技術用于小麥品質育種親本評價和雜交聚合優質亞基基因小麥新品種的選育。在其他植物分子育種實踐中，多重PCR技術體系的建立和應用研究也相繼展開。

3 多重PCR技術在植物生物學研究中的應用前景

分子方法研究植物是近20年植物生物學研究的重要發展階段，而許多分子方法的推進都是基于新的PCR技術的開發和應用。相對單一PCR而言，多重PCR具有極大的優越性:一次PCR反應中能同時檢測多個基因型，因而高效、快捷、經濟;PCR反應中高度特異敏感，因而保證了擴增結果的準確、可靠;試驗操作簡單、程序化、耗時少，在一定程度上加速了試驗進程。這些優點使得多重PCR在多個方面得到了飛速發展，已經在人類學、動物學、植物學、微生物學、食品學研究等方面得到了廣泛應用［42］。

由于多重PCR是在同一體系中進行復合擴增，故其在植物生物學研究的實踐中不可避免地存在一定的問題和缺陷，如可能存在多對引物之間的相互抑制、引物與非靶序列的結合產生非特異性擴增，等。因此，在多重PCR的應用中，如何合理設計引物，優化最佳多重PCR體系及反應條件以減少非特異性擴增至關重要。這通常需要基于反應中的主要成分和反應條件進行多次優化后以確定一個成熟的反應體系，再視不同模板和引物來適當調整試驗條件［43］。也有一些研究者直接應用與成熟的單一PCR反應完全相同的條件，在遵循引物組合的一般原則下進行多重PCR試驗，同樣取得了令人滿意的結果［44］。這樣可以避免為建立多重PCR反應體系需要進行的繁瑣優化試驗，也相應拓展了多重PCR技術在實際中的應用范疇。

隨著多重PCR技術的不斷發展應用，其與其他技術的結合也越來越多。如將多重PCR與毛細管電泳技術結合，可以提高基因分裂效率和檢測的準確度［45］;將多重PCR與四色熒光技術結合，可以提高檢測的靈敏度和縮短檢測時間［46］，等。今后，隨著現代生物技術的發展，多重PCR技術及與其他技術的結合在植物生物學研究中越來越受到廣大植物學家們的青睞，尤其是在DNA遺傳分析和基因檢測方面具有廣闊的應用前景和發展方向。

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