禽原始生殖細胞的分離·培養及應用

李 璐，李俊杰，2* ，曹 慧，李祥龍(.河北農業大學動物科技學院，河北保定 07000;2.河北省牛羊胚胎工程技術研究中心，河北保定07000;.河北科技師范學院，河北秦皇島066000)

在胚胎時期主要有2種細胞具有多向分化潛能，分別是胚胎干細胞(Embryonc stem cell，ES)和胚胎生殖細胞(Embryonic germ cell，EG)。前者來源于胚胎早期囊胚階段，后者來源于胚胎生殖嵴的原始生殖細胞(Primordial germ cell，PGC)——動物生殖細胞的原始祖先細胞。在雌性和雄性動物中PGCs可分別形成卵原細胞和精原細胞，其在形態、表面標志和分化潛能方面都類似于ES細胞。另外，由于雞卵中含有大而多的卵黃，其受精后的整個孵化過程需在含有大量卵清的蛋殼內進行，這些特殊的生理特性使PGCs成為研究禽類胚胎發生、細胞分化機制、發育相關調控基因等研究的良好模型。基于此，筆者對PGCs的特性、分離培養及應用等研究研展進行了綜述。

1 禽類PGCs的特性

原始生殖細胞(PGCs)是具有高度未分化的發育全能性細胞。將剛分離到的PGCs在倒置相差顯微鏡下觀察發現它比體細胞體積大，細胞核較大，位置偏中央，細胞周圍有明顯光環，有的具有偽足［1］。此外，PGCs細胞具有集落的顯著特征，Wentwrth等發現PGCs細胞在飼養層上呈集落狀生長，排列緊密，細胞間界限不清楚，生長特征表現為PGCs集落間常發生聚集現象。PGCs內含有大量的糖原顆粒，并且具有較高的堿性磷酸酶活性，但是已分化的PGCs糖原含量及AKP活性明顯降低［2］。秦潔等研究發現PGCs憑借其細胞質中大量糖原顆粒的沉積，可通過PAS染色將其余糖原顆粒相對較少的體細胞區分，其染色特征為細胞核不著色，細胞質呈紅色［3］。經過PAS染色后的PGCs細胞形態變化不一，有的由圓變長，有的變為橢圓形，還有個別PGCs細胞仍保持圓形，有的還在頂端伸出偽足，核外胞質呈現許多深染的區域［4］。對于禽類PGCs，秦潔等報道其為圓形，HE(Hematoxylin-eosin)染色后精原細胞為圓形，體積較大，核著色較深;支持細胞形狀不規則，有圓形、錐形，體積較精原細胞小，著色較淺;間質細胞一般成群分布在曲精細管索之間［5］。

2 PGCs的分離培養

PGCs在禽胚胎的早期發育過程中有其獨特的遷移規律［6］，從而能被分離提取，并可移植到同種胚胎中，發育成有功能的配子。在血液循環系統建立后，禽類PGCs首先通過血液循環到達原始生殖嵴部位，并在其中分化成配子。根據禽類PGCs的獨特遷移路線，通常在以下3個階段進行PGCs的分離:①從5期胚的生殖新月區提取;②從10～13期胚的血液中提取;③從生殖腺中提取。

為了掌握分離PGCs的最適時間，李碧春等比較了孵育48～60 h分離后PGCs的濃度，發現孵化52～54 h(13～15期)胚胎中PGCs濃度最大(1%以上)，48、56、60 h的雞胚中PGCs濃度較小(1%以內)，且孵化48 h(12期)的雞胚不容易獲取 PGCs，因此分離 PGCs的時間以孵化52～54 h為宜［7］。

PGCs不同的分離部位，對最終分離效果也有顯著影響。Naeemipour等通過檢測雞胚HH14期(此時大部分PGCs進入血液循環)、HH18期(此時PGCs已經在血液循環中停留8～12 h)和HH28期(大部分PGCs遷移到生殖嵴)中PGCs多能性基因表達譜的變化，發現Oct4、Sox2、Nanog基因的轉錄物不斷減少的現象不是轉錄抑制的結果［8］。與血液PGCs相比，性腺PGCs已經失去了形成集落的能力;與哺乳動物PGCs相比，禽類PGCs多能性基因的表達不斷被抑制，在生殖細胞系遷移的不同階段多能性逐步喪失。為了保持禽類原始生殖細胞的多能性，其最優分離部位還有待深入研究。

不同的分離方法也直接影響最終分離效果。前人已經報道了很多PGCs的分離純化方法［8－10］，但大多數是用梯度離心法從血液中提取［8－9，11］。體外操作的需要大量的 PGCs，但研究發現通過此方法提取的PGCs的絕對數量較少。通過研究PGCs的遷移路線發現，在原始生殖腺中PGCs相對集中且有大量增殖，是供體外培養PGCs很好的來源。秦潔等［12］報道與Ficoll密度梯度離心法相比酶解離法分離到PGCs的相對數量較多，存活時間較長，是一種較可行的分離方法。李碧春等也報道酶解法分離到的PGCs的相對數量較Ficoll密度梯度離心法多，存活時間較長，是一種適宜的分離方法［13］。Alvarez等采用酶解法分離PGCs，但分離產物中體細胞含量較高，在培養1 h左右這些體細胞分化為成纖維細胞。成纖維細胞可與PGCs協同競爭生存，并且可分泌大量生長因子，如IGF(Insulin-like growth factor)和EGF(Epidermal growth factor)，有利于PGCs的存活增殖;同時也釋放分化抑制因子，如LIF(Leukemia inhibitory factor)，抑制PGCs分化和凋亡。在基于前人研究的基礎上，還需要對禽類PGCs的分離方法、部位和時間等關鍵性問題進行深入探索。

PGCs的體外培養環境精確而復雜，維持其未分化的狀態是體外培養技術的關鍵。飼養層細胞及多種細胞因子在PGCs體外培養技術中起著舉足輕重的作用。飼養層細胞(STO細胞、小鼠成纖維細胞/MEF、雞成纖維細胞/CEF和性腺基質細胞/SCs等)一方面可以促進PGCs的附著，另一方面可以分泌一些促生殖抑分化的細胞因子。維持PGCs體外存活的必需生長因子(干細胞生長因子/SCF、白血病抑制因子/LIF、堿性成纖維生長因子/bFGF和胰島素樣生長因子－1/IGF－1等)能夠增強PGCs的增殖并保持其發育全能性。

秦潔等［14］使用傳至第3代的CEF作為飼養層，可將經冷凍保存的雞PGCs傳至6代。王娟等［15］研究表明MEF比STO更適宜作為飼養層來培養胚胎生殖細胞，能更好地維持PGCs的正常核型，使其連續增值。Hoyer等［16］研究表明SCF能夠維持細胞的存活和凋亡，并通過cAMP的調節對細胞的有絲分裂產生影響。Farini等［17］研究發現LIF是由體細胞產生的，能夠通過對體細胞的作用改變PGCs凋亡和增殖的狀態。謝蓓等可將雞PGCs傳至23代，且每代增殖近10倍，其使用堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、人胰島素樣生長因子(hIGF－1)、小鼠白血病抑制因子(mLIF)與5 d雞胚胎性腺基質細胞共培養［18］。研究表明，在培養基中添加大量生長因子的同時，加入5 d雞胚性腺基質細胞，為PGCs提供良好的微環境，促進其增值。多種生長因子和基質細胞的結合作用，改變了PGCs的發育程序，阻斷其向成熟生殖細胞分化，同時刺激其大量增殖［19］。因此，對飼養層細胞與生長因子的相互作用進行研究也將對PGCs的體外培養做出貢獻。

3 PGCs的應用

生產嵌合體、制備轉基因家禽、提高家禽生產性能及抗病能力，使得家禽PGCs細胞在生物制藥產業以及家禽相關研究中發揮不可估量的作用。另外，由于家禽不易獲得單細胞受精卵，家禽PGCs細胞在搶救和保護瀕危珍稀禽類遺傳資源方面，也將提供新的思路與方法［20］。

3.1 PGCs在禽類嵌合體制備上的應用 已有研究表明，將長期的低溫冷凍保存的原始生殖細胞(PGCs)，解凍后移入受體胚胎可以產生可育的生殖嵌合體，將生殖嵌合體的禽類自交，可以產生珍稀的禽類資源。因此，應用PGCs進行禽類嵌合體的制備具有重要的生物學意義。Naito等通過分離不同毛色的雞的PGCs，制備了嵌合體，并且成功地從F1代中獲得了來自供體PGCs的后代［21］。Chang等通過移植不同品系鵪鶉的PGCs制備了嵌合體，獲得了來自供體PGCs的后代［22］。Yasuda等［23］和 Ohno等［24］在鵪鶉與雞之間移植血液中PGCs，鵪鶉PGCs可在雞性腺中生存。李贊東等成功制備了鴨雞種間嵌合體，其利用了胚盤細胞移植法并獲得了1只種系嵌合體［25］。劉春海等將分離的原始生殖細胞以微注射法轉移至14～15期麻鴨胚胎中制備了雞鴨種間嵌合體，獲得8只雛鴨(8/110)。以雞W特異DNA探針原位雜交法在早期鴨胚性腺中檢測到雞原始生殖細胞，嵌合率達84.2%(16/19)［26］。Bednarczyk等成功制備了綠腿鷓鴣－白來航雞的生殖嵌合體，其中供體為綠腿鷓鴣，受體為白來航雞，并將得到的雄雌生殖嵌合體雞互相交配產生了純合的轉基因綠腿鷓鴣后代［27］。迄今為止，禽類嵌合體制備的效率都很低。因此，制備嵌合體模型的條件對于恢復珍稀瀕危品種以及品種資源多樣性保護和利用起到至關重要的作用，對其條件的深入探索將是未來研究的重要方面。

3.2 PGCs在轉基因禽類的應用 與哺乳動物不同，禽類胚胎中的PGCs經過由血管向性腺遷移的過程，最終在性腺中轉變為精子和卵子。目前，利用乳腺作為生物反應器生產珍貴醫用蛋白質已有不少成功的報道，禽類與哺乳動物相比在該領域的研究發展相對滯后。轉基因雞可作為一種生物反應器，生產具有重要價值的藥用蛋白。傳統的禽類轉基因研究擁有復雜的操作手法，包括精子載體轉基因法、反轉錄病毒載體轉基因法、受精卵移植法、單細胞受精卵微注射法等。然而，傳統的轉基因方法在物種之間有明顯的局限性。利用原始生殖細胞(PGCs)嵌合體法進行轉基因禽類生產，與其他方法相比是卓有成效的，可從整體上減少時間、設備以及試劑的需求。這種方法使研究者在沒有大量PGCs培養設施存在或缺少實現廣泛生產轉基因雞的條件的情況下，進行簡單有效的轉基因雞生產。因此，在技術水平發展提高的基礎上，結合家雞個體小、世代間隔短、生產性能高、維持種群容易的特點，PGCs最適于轉基因家雞的研究，并且在地方雞種保護方面也具有重要的應用價值。Chapman等利用慢病毒載體導入法將外源基因導入胚胎后，綠色熒光蛋白可以在全身廣泛表達［28］。

Van de Lavoir等研究發現禽類PGCs經遺傳修飾后仍具有進入生殖系的能力，并可在體外誘導分化為胚胎生殖細胞(Embryonic germ cells，EG細胞)，進而產生所有的體組織，并通過電轉法利用PGCs獲得了體外高表達的轉綠色熒光蛋白的后代［29］。Chojnacka－Puchta等［30］已通過控制禽類轉移到胚胎的PGCs產生生殖系嵌合體來生產轉基因雞。

4 存在問題及應用前景

通過體外分離培養獲得大量可用PGCs，為制備嵌合體及轉基因雞的研究奠定了基礎。酶解離法與Ficoll密度梯度離心法被用作分離PGCs的常用方法。各種飼養層以及生長因子在PGCs體外培養體系中也屢見不鮮。在其分離培養中，酶處理時間過長以及絲裂霉素處理飼養層后其殘留物質對PGCs的損傷等問題仍需要進一步改善。原始生殖細胞具有特殊的發育分化過程，具有明顯的干細胞性質，若將其成功培養成系，即建立胚胎多潛能干細胞系，將對干細胞研究做出巨大貢獻，為禽類胚胎發育及轉基因模型的建立等提供更好的平臺。

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