水貂阿留申病診斷技術(shù)的研究進(jìn)展

張 蕾，馬凡舒，孫彥剛，王 洋，閆喜軍，徐淑娟 (中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林長(zhǎng)春130122)

水貂阿留申病(Aleutian disease，AD)是由細(xì)小病毒科阿留申病毒屬的水貂阿留申病毒(Aleutian disease virus，ADV)感染引起的。水貂發(fā)病的癥狀與病毒和動(dòng)物的自身情況相關(guān)。不同的病毒毒株，動(dòng)物的不同基因型和年齡表現(xiàn)的癥狀表現(xiàn)不同。經(jīng)典的AD癥狀在成年水貂表現(xiàn)為自身免疫綜合癥，患病水貂高r-球蛋白血癥、腎小球腎炎、動(dòng)脈血管炎，水貂繁殖能力大大下降。幼貂常發(fā)生急性間質(zhì)性肺炎。ADV可以感染多種動(dòng)物，如雪貂、藍(lán)狐、貉子、浣熊、灰狐、水獺等［1-5］。國(guó)外有飼養(yǎng)場(chǎng)工人感染ADV最終表現(xiàn)為經(jīng)典的ADV臨床癥狀并死亡的報(bào)道［6］。

診斷是防控該病的重中之重。阿留申病患病水貂臨床表現(xiàn)為消瘦，口渴。通常依據(jù)癥狀淘汰病貂，確診則需要在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行對(duì)流免疫電泳(Counter immuno electrophoresis，CIEP)檢測(cè)。CIEP是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的ADV診斷方法。但是，CIEP不利于臨床的推廣和實(shí)現(xiàn)樣品的高通量檢測(cè)，近年來，國(guó)外學(xué)者報(bào)道了PCR、熒光定量PCR和ELISA等診斷方法，這些方法突破了CIEP診斷的局限。筆者對(duì)ADV的最新研究技術(shù)進(jìn)行了綜述。

1 AD抗體鑒定

AD抗體鑒定主要分特異性試驗(yàn)和非特異性試驗(yàn)。非特異性試驗(yàn)有碘凝集試驗(yàn)、血清蛋白電泳和戊二醛試驗(yàn)。這些方法常常造成假陽性結(jié)果，導(dǎo)致水貂誤殺。特異性試驗(yàn)主要有間接免疫熒光、補(bǔ)體固定和對(duì)流免疫電泳試驗(yàn)CIEP。CIEP試驗(yàn)最早在20世紀(jì)70年代建立，是診斷AD的國(guó)際公認(rèn)方法，CIEP診斷抗原主要采用感染動(dòng)物的臟器研磨獲得。從20世紀(jì)80年代開始，抗原的制備采用可傳代的ADV-G株感染CRFK細(xì)胞進(jìn)行制備。為了提高CIEP試驗(yàn)的敏感性和特異性，又陸續(xù)對(duì)CIEP試驗(yàn)進(jìn)行改進(jìn)。添加劑CIEP及火箭CIEP等技術(shù)相繼出現(xiàn)。最敏感的是逆流線吸收免疫電泳(CCLAIE)，對(duì)3 321份樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明CIEP與CCLAIE相比，試驗(yàn)的敏感性為79%，特異性為99%，CCLAIE檢測(cè)的抗體滴度為 1∶4 096，遠(yuǎn)高于 CIEP(1∶256)［7］。

2 PCR法

ADV基因組全長(zhǎng)近5 kB，編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1，VP2和非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2、NS3。在VP2和NS基因上存在高變區(qū)，依據(jù)VP2基因高變區(qū)和NS基因高變區(qū)分別可以給水貂分為3 個(gè)型和 4 個(gè)型［8-9］。以高變區(qū)序列為基礎(chǔ)，Saifuddin［6］建立了診斷ADV和FADV的限制性內(nèi)切酶診斷方法。1996年，Qie應(yīng)用PCR擴(kuò)增VP2基因的高變區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)浣熊和臭鼬感染水貂阿留申病毒［10］。2013年，張蕾等利用PCR技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)貉感染水貂阿留申病毒［11］。在診斷AD方面，Bloom［12］利用PCR鑒定了97份樣品，與CIEP診斷的結(jié)果比對(duì)發(fā)現(xiàn)，對(duì)流免疫電泳診斷樣品的陽性率為97%，而PCR診斷樣品的陽性率為62%。這種差異的產(chǎn)生可能是由于病毒感染本身的特征引起的，病毒感染動(dòng)物呈現(xiàn)血清學(xué)陽性，病毒學(xué)陰性。

2011年，TrineH.Jensen［13］比對(duì)了 PCR 和 CIEP 2 種方法檢測(cè)ADV的差異。在55個(gè)已知感染ADV和8個(gè)未感染ADV的農(nóng)場(chǎng)，共采集299份水貂脾臟和淋巴結(jié)及血清樣品。結(jié)果表明，與CIEP相比PCR診斷的敏感性為94.7%，特異性為97.9%。PCR與CIEP診斷方法具有較高的一致性。

3 熒光定量PCR

2014年，Alberto Prietoa建立了ADV實(shí)時(shí)定量PCR方法，該方法有利于分析ADV的傳播途徑，從10個(gè)農(nóng)場(chǎng)選取了79例臨床環(huán)境樣品，樣品采集廣泛，包括飼養(yǎng)場(chǎng)排放的廢水、養(yǎng)殖區(qū)工作人員的腳套、衣物、飼料堆積的倉庫、動(dòng)物存放的籠壁、工作人員使用的餐廳及會(huì)議區(qū)、運(yùn)送飼料的交通工具、環(huán)境中土壤的表面和運(yùn)輸卡車經(jīng)過的車轍等。結(jié)果表明，已確定感染的飼養(yǎng)場(chǎng)中93.9%的樣品呈現(xiàn)ADV陽性。研究還發(fā)現(xiàn)，已發(fā)病的飼養(yǎng)場(chǎng)和未發(fā)病的飼養(yǎng)場(chǎng)存在人攜帶傳播病原體的因素。在直接接觸感染動(dòng)物的器具和衣物表面的ADV的含量遠(yuǎn)大于環(huán)境中其他的樣品(衣物、鞋套和飼養(yǎng)場(chǎng)使用的交通工具)對(duì)ADV的傳播都有重要的作用。此外，PCR發(fā)現(xiàn)剖檢的動(dòng)物器官中帶毒，但PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)相應(yīng)動(dòng)物糞便為陰性，說明感染的動(dòng)物糞便的排毒是間斷的，即便是糞便檢測(cè)結(jié)果提示PCR結(jié)果呈陽性，也不能說明水貂呈現(xiàn)致病狀態(tài)。因此，不能通過PCR檢測(cè)動(dòng)物糞便確定動(dòng)物是否發(fā)生感染［14］。熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立為評(píng)估ADV的傳播途徑提供了基礎(chǔ)信息，有利于了解病原體在環(huán)境中的分布和評(píng)估病毒感染的高危因素，為傳統(tǒng)的根除ADV計(jì)劃提供了準(zhǔn)確的臨床理論數(shù)據(jù)和資料。

4 ELISA法

1982年，Wright RF［15］報(bào)道了以氟碳滅活的ADV抗原開發(fā)的ELISA試劑盒，在診斷進(jìn)行性的感染水貂時(shí)敏感性很高，但非進(jìn)行性ADV病貂的感染性低。ELISA在檢測(cè)ADV方面不如CIEP試驗(yàn)有效。

2009年，Anna Knuuttila［16］利用昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)在SF9細(xì)胞中表達(dá)了一ADV野毒株的VP2蛋白，并驗(yàn)證以之為抗原CIEP試驗(yàn)的檢測(cè)效果，結(jié)果表明與傳統(tǒng)商業(yè)抗原相比，該抗原診斷AD的敏感性和特異性為100%。利用重組蛋白為抗原，建立了ADV的ELISA診斷方法。共采集316份血清樣品，對(duì)重組蛋白進(jìn)行CIEP檢測(cè)，結(jié)果表明211份樣品為ADV陰性，105份樣品ADV陽性。重組蛋白ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，206份樣品為陰性，105份樣品為陽性。以重組蛋白為基礎(chǔ)的 ELISA法與CIEP相比，診斷ADV的敏感性為99%，特異性為97%。二者具有較好的一致性。

2013年，Anna MariaAnder［17］分別用以美國(guó) ADV-G 為抗原開發(fā)的ELISA試劑盒和Anna Knuuttila表達(dá)的重組蛋白建立了ELISA診斷方法，并對(duì)比了2種ELISA方法檢測(cè)ADV的差異，發(fā)現(xiàn)當(dāng)應(yīng)用CIEP陰性樣品的OD值加上3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方差作為cut-off值時(shí)，重組蛋白為基礎(chǔ)的ELISA與CIEP相比診斷樣品的敏感性為99.7%，特異性為98.3%。當(dāng)以說明書推薦的陰性對(duì)照為cut-off值，ADV-G株抗原為基礎(chǔ)的ELISA與CIEP試驗(yàn)相比診斷的敏感性為54.3%，特異性為93.2%。采用CIEP陰性樣品的OD值加上3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方差作為cut-off值時(shí)，診斷的敏感性為37.6%，特異性為98.3%。因此，以商業(yè)抗原為基礎(chǔ)的ELISA試驗(yàn)敏感性較低。

2014年，Rebekka Dam-Tuxen［18］對(duì)比了以丹麥的 ADV-G為抗原建立的ELISA方法和CIEP試驗(yàn)的敏感性和特異性，共采集3 810份血清樣品，ELISA試驗(yàn)與CIEP試驗(yàn)相比敏感性更高，特異性略低。ELISA試驗(yàn)可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè)，每天可以檢測(cè)38 000份血清樣品。

2014年，Anna MariaAnder［19］報(bào)道了芬蘭應(yīng)用全自動(dòng)的ELISA方法在國(guó)內(nèi)實(shí)現(xiàn)高通量的ADV血清檢測(cè)，每年可以檢測(cè)3 000 000～4 000 000份樣品。與CIEP試驗(yàn)相比，全自動(dòng)ELISA方法的敏感性為96.2%，特異性為98.4%。CIEP與ELISA試驗(yàn)具有很高的一致性，Kappa值為0.976，總體的一致性為98.8%。目前，丹麥也實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化ELISA檢測(cè)ADV的服務(wù)。

5 試紙條

目前，美國(guó)農(nóng)場(chǎng)已應(yīng)用膠體金診斷試紙?jiān)\斷ADV感染，但未見到有關(guān)報(bào)道。徐磊［20］利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)ADV病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP2的部分基因片段，并以之為基礎(chǔ)建立了診斷ADV的膠體金側(cè)向?qū)游鲈\斷方法。

6 小結(jié)

綜上所述，CIEP是診斷水貂阿留申病的國(guó)內(nèi)外公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)，防控該病的主要手段是對(duì)該疾病的診斷，在水貂引種時(shí)檢測(cè)動(dòng)物帶毒情況;每年結(jié)合打皮期，診斷淘汰病貂，并對(duì)環(huán)境進(jìn)行消毒，這些措施雖然有效延緩了ADV的傳播進(jìn)程，但ADV仍然頻繁出現(xiàn)。PCR方法的出現(xiàn)彌補(bǔ)了CIEP診斷方法的漏診，qPCR方法的建立有利于評(píng)估ADV感染的可能途徑，試紙條方法有利于臨床ADV快速診斷，ELISA方法實(shí)現(xiàn)了ADV的高通量自動(dòng)化診斷。國(guó)內(nèi)亟需開發(fā)有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的ADV診斷的新產(chǎn)品。

［1］ALEXANDERSEN S，JENSEN A U，HANSEN M，et al.Experimental transmission of Aleutian disease virus(ADV)to different animal species［J］.Acta Pathol Microbiol Immunol Scand B，1985，93(3):195-200.

［2］INGRAM D G，CHO H J.Aleutian disease in mink:virology，immunology and pathogenesis［J］.J Rheumatol，1974，1(1):74-92.

［3］KENYON A J，KENYON B J，HAHN E C.Protides of the Mustelidae:immunoresponse of mustelids to Aleutian mink disease virus［J］.Am J Vet Res，1978，39(6):1011-1015.

［4］LI L，PESAVENTO P A，WOODS L，et al.Novel amdovirus in gray foxes［J］.Emerg Infect Dis，2011，17(10):1876-1878.

［5］MURAKAMI M，MATSUBA C，UNE Y，et al.Nucleotide sequence and polymerase chain reaction/restriction fragment length polymorphism analyses of Aleutian disease virus in ferrets in Japan［J］.J Vet Diagn Invest，2001，13(4):337-340.

［6］JEPSEN J R，D’AMORE F，BAANDRUP U，et al.Aleutian mink disease virus and humans［J］.Emerg Infect Dis，2009，15(12):2040-2042.

［7］AASTED B，ALEXANDERSEN S，COHN A，et al.Counter current line absorption immunoelectrophoresis in an alternative diagnostic screening test to counter current immunoelectrophoresis in Aleutian disease(AD)eradication programs［J］.Acta Vet Scand，1986，27(3):410-420.

［8］BLOOM M E，ALEXANDERSEN S，PERRYMAN S，et al.Nucleotide sequence and genomic organization of Aleutian mink disease parvovirus(ADV):sequence comparisons between a nonpathogenic and a pathogenic strain of ADV［J］.J Virol，1988，62(8):2903-2915.

［9］OLOFSSON A，MITTELHOLZER C，TREIBERG BERNDTSSON L，et al.Unusual，high genetic diversity of Aleutian mink disease virus［J］.J Clin Microbiol，1999，37(12):4145-4149.

［10］OIE K L，DURRANT G，WOLFINBARGER J B，et al.The relationship between capsid protein(VP2)sequence and pathogenicity of Aleutian mink disease parvovirus(ADV):a possible role for raccoons in the transmission of ADV infections［J］.J Virol，1996，70(2):852-861.

［11］張蕾，胡博，王振軍，等.我國(guó)首次證實(shí)貉感染水貂阿留申病毒［J］.病毒學(xué)報(bào)，2013，29(6):680.

［12］BLOOM M E，MARTIN D A，OIE K L，et al.Expression of Aleutian mink disease parvovirus capsid proteins in defined segments:localization of immunoreactive sites and neutralizing epitopes to specific regions［J］.J Virol，1997，71(1):705-714.

［13］JENSEN T H，CHRISTENSEN L S，CHRIEL M，et al.Implementation and validation of a sensitive PCR detection method in the eradication campaign against Aleutian mink disease virus［J］.J Virol Methods，2011，171(1):81-85.

［14］PRIETO A，DIAZ-CAO J M，F(xiàn)ERNANDEZ-ANTONIO R，et al.Application of real-time PCR to detect Aleutian Mink Disease Virus on environmental farm sources［J］.Vet Microbiol，2014，173(3/4):355-359.

［15］WRIGHT P F，WILKIE B N.Detection of antibody in Aleutian disease of mink:comparison of enzyme-linked immunosorbent assay and counterimmunoelectrophoresis［J］.Am J Vet Res，1982，43(5):865-868.

［16］KNUUTTILA A，ARONEN P，SAARINEN A，et al.Development and evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay based on recombinant VP2 capsids for the detection of antibodies to Aleutian mink disease virus［J］.Clin Vaccine Immunol，2009，16(9):1360-1365.

［17］ANDERSSON A M，WALLGREN P.Evaluation of two enzyme-linked immunosorbent assays for serodiagnosis of Aleutian mink disease virus infection in mink［J］.Acta Vet Scand，2013，55:86.

［18］DAM-TUXEN R，DAHL J，JENSEN T H，et al.Diagnosing Aleutian mink disease infection by a new fully automated ELISA or by counter current immunoelectrophoresis:a comparison of sensitivity and specificity［J］.J Virol Methods，2014，199:53-60.

［19］KNUUTTILA A，ARONEN P，EEROLA M，et al.Validation of an automated ELISA system for detection of antibodies to Aleutian mink disease virus using blood samples collected in filter paper strips［J］.Virol J，2014，11:141.

［20］徐磊.水貂阿留申膠體金免疫層析診斷方法的初步建立［D］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2010.