多發性肌炎并肺間質病變血清蛋白質組學研究

李秋蘭，章 濤，洪文婷，林夏鴻，林 玲，陳小青

多發性肌炎（polymyositis，PM）是以累及橫紋肌為特征的結締組織病，常合并肺間質病變（interstitial lung disease，ILD），嚴重影響患者的預后，目前其發病機制尚不明確。筆者科室于2011年11月—2013年11月收治部分PM及PM＋ILD患者，通過雙向電泳與質譜分析患者血清中表達的差異蛋白，并與正常人群比較，探討PM的發病機制，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 對象 PM患者3例，男性1例，女性2例，年齡分別為45，48，39歲。PM＋ILD患者3例，男性1例，女性2例，年齡分別為50，46，44歲?；颊呔螧ohan和Peter的PM診斷標準，并行肺部薄層CT檢查判斷是否伴發ILD。另外收集正常對照組3例，男性1例，女性2例，年齡分別為43，46，48歲。

1.2 方法

1.2.1 試劑 BCA蛋白定量試劑盒（編號：AR0146，中國碧云天公司）；IPG 預制膠條（PH3－10，24cm）、3－[（3－膽酞胺醛）－二乙胺1－丙磺]、二硫蘇糖醇、丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉、尿素、考馬斯亮藍R350、碘乙酰胺等（美國GE公司）；甘氨酸、低熔點瓊脂糖、N，N’－甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺、Tris堿、溴酚藍等（美國Sigma公司）；人微量轉鐵蛋白（MTF）酶聯免疫分析試劑盒（美國R ＆ D公司）。

1.2.2 儀器 等電聚焦系統（Ettan IPGphor III）、垂直 電 泳 系 統 （ESP601、Multi Temp Ⅳ）、Image Master 2D分析系統（Platinum 7.0）、掃描儀（美國GE公司）；多功能酶標儀（Sunrise，德國Tecan公司）。

1.2.3 測定生化指標 總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）等采用全自動生化分析儀檢測（CX－5型，美國Beckman公司）。

1.2.4 采集與制備標本 每例患者取靜脈血6mL，室 溫 下 放 置 20min，3 000r／min 離 心15min，取上清，BCA法測定蛋白濃度，計算所需的血清量，保證每個樣本含等量蛋白。分別將PM、PM＋ILD、對照組3組血清池混制，并分裝成3管，－80℃冰箱保存備用。

1.2.5 雙向凝膠電泳 將3組血清在相同參數條件下進行平行雙向電泳，電泳凝膠用考馬斯亮蘭染色。染色后的雙向電泳凝膠圖像用掃描儀掃入電腦，經Image Master系統分析凝膠圖像。3組的凝膠圖譜進行匹配比對分析。設置平滑（smooth＝10）、顯著值（saliency＝2）、最小區域（min area＝5）等參數進行斑點檢測，設置landmark蛋白點后進行匹配。數據分析后選取光密度差異（ratio）＞2且差別具有統計學意義（P＜0.05）的蛋白質點為差異表達的蛋白。

1.2.6 基質輔助激光解析電離飛行時間質譜（MALDI－TOF－MS）） 挖取有明顯差異的蛋白點凝膠送昆明賽金公司進行MALDI－TOF－MS分析。利用Mascot搜索引擎，進行MS／MS離子搜索；對獲得的肽指紋在SwissProt和NCBI數據庫搜索，分析鑒定蛋白。

1.2.7 ELISA方法驗證 擴大樣本的例數進行驗證，共收集PM 或皮肌炎（dermatomyositis，DM））組30例（其中PM患者13例、DM 患者17例）、PM＋ILD組6例、DM＋ILD組8例、系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）組18例、正常對照組15例，用ELISA方法進行驗證。SLE組為疾病對照組，滿足無合并肺間質疾病，無發生感染，無合并惡性腫瘤等因素，SLE的診斷符合1997年美國風濕病學會（ACR）修訂的SLE分類標準。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件包行統計分析，計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，對于顯著偏態分布的資料的組間比較采用Mann－WhitneyU檢驗。P＜0.05為差別具有統計學意義。

2 結 果

2.1 血清蛋白質組的蛋白點差異分析 將PM、PM＋ILD、對照組的混合血清在同等條件下重復進行3次雙向電泳，獲得3組蛋白圖譜。其中PM組3張圖找到的蛋白質點為（252±11）個，匹配率平均為78.00%；PM＋ILD組找到的蛋白質點（235±8）個，匹配率平均為80.305%；對照組找到的蛋白質點為（239±7）個，匹配率平均為79.160%。3組的差異蛋白點進行組間比較：與對照組比較，PM組和PM＋ILD組同時表達且表達上調的差異蛋白點有20個、表達下調的4個；與PM組比較，PM＋ILD組表達上調的差異蛋白點有2個，表達下調的7個（表1）。對3組的差異蛋白點進行兩兩比較，有15個明顯差異蛋白點（表2）。3組各取一張蛋白質組的雙向電泳圖譜（圖1）。

2.2 質譜鑒定 挖取15個差異明顯的蛋白點凝膠送檢，經質譜分析鑒定出9種蛋白：（1）與對照組比較，PM組有4個差異蛋白表達上調，1個差異蛋白表達下調，表達上調的差異蛋白成功鑒定為血清淀粉樣蛋白A（serum amyloid A protein，SAA）、載脂蛋白 A1（apolipoprotein A－1，apoA－1）、凝 集 素（clusterin，CLU）、血清白蛋白（serum albumin，ALB）；表達下調的差異蛋白鑒定為轉鐵蛋白（serotransferrin，TRF）。PM＋ILD組有4個差異蛋白同時表達下調，成功鑒定為 TRF、鋅－a2－糖蛋白（zinc－alpha－2－glycoprotein，ZAG）、a2－H2－糖 蛋 白（alpha－2－HS－glycoprotein，AHSG）、a1－β－糖 蛋 白（alpha－1B－glycoprotein，A1BG）。（2）與 PM 組比較，PM＋ILD組的2個差異蛋白同時表達下調，鑒定為β2－糖蛋白1（beta－2－glycoprotein 1，β2－GP1）和TRF。成功鑒定出的差異蛋白質質譜結果見表3。

表1 PM組、PM＋ILD組及對照組同時表達差異的蛋白質點Tab 1 Differential espressed protein in PM，PM＋ILD and HD

表2 PM組、PM＋ILD組及對照組比較表達差異的蛋白質點Tab 2 Differential espressed protein among PM，PM＋ILD and HD

2.3 生化指標比較 PM與PM＋ILD組患者的TC與TG水平均明顯高于對照組（P＜0.05），且PM＋ILD組 TC水平高于PM 組（P＜0.05），而TG水平在2組間比較差別無統計學意義（P＞0.05，表4）。

圖1 PM組、PM＋ILD組及對照組的雙向電泳圖Fig 1 Gels figure of PM，PM＋ILD and HD

表3 成功鑒定的蛋白質質譜結果Tab 3 The success of protein mass spectrometry identification results

表4 PM、PM＋ILD與對照組的TC、TG比較Tab 4 TC，TG of PM，PM＋ILD and HD mmol／L

2.4 TRF在組間的比較 TRF的血清濃度在PM、DM、PM＋ILD、SLE、對照組各組間比較，差別均無統計學意義（P＞0.05，表5）。

表5 TRF在PM、PM＋ILD、SLE和對照組間的比較Tab 5 TRF of PM，DM，PM＋ILD，SLE and HD

3 討 論

現有的研究提示，免疫機制（包括細胞免疫和體液免疫）和非免疫機制均與肌炎患者肌纖維損傷和肌肉功能障礙有關，但是不同機制的具體作用及機制間是否有交叉作用，目前皆不清楚。蛋白質組學可應用于探索復雜疾病的致病機制及尋找疾病診斷分子標記蛋白，目前國外開始嘗試將其用于特發性炎癥性肌病的研究[1]。本研究應用蛋白質組學對PM組、PM＋ILD組與對照組的血清進行分析，成功鑒定出9種蛋白質，以下對它們可能發揮的功能進行討論：

3.1 可能參與PM發病進程的蛋白 SAA作為載脂蛋白家族中的高度異質類蛋白，是一種非常敏感的急性時相反應物[2－3]，也是監測炎癥（包括 DM）的指標[4－6]。SAA 的前體即淀粉樣原纖維（AA）對PM患者血管的基底膜、細胞、細胞器膜、核膜進行細胞毒性作用[7]，促使PM的血管內皮增厚、基底膜改變及血管增殖等，造成皮膚損害與ILD。CLU是一種硫化二聚體糖蛋白，具有組織損傷后重建、脂質轉運、細胞粘附、調節細胞凋亡、調節補體活化等功能[8]。PM是一種自身免疫性疾病，可產生多種抗體[9]。CLU作為補體溶解抑制物，與 C5b－9相作用，使免疫復合物喪失活性，阻止抗體依賴補體介導的細胞溶解及炎癥反應[10－11]，從而限制補體介導炎癥反應。另外，細胞內CLU是新一代的惰性細胞毒素的變體，參與慢性內質網應激反應[12]，造成肌肉缺氧、損傷。CLU起保護機制因素還是致病性因素，值得進一步研究。

apoA－1是一種負急性時相蛋白，可抑制炎癥過程多個環節，起抗炎癥保護作用[13]。ALB在一定程度上反應體內炎癥反應程度和患者一般消耗狀態[14]。低白蛋白癥是PM預后不良的獨立危險因素，也是PM合并ILD的預測因子[15]。在本次研究中，apoA－1、ALB對PM組患者可能起的是反饋性保護功能。

β2－GP1是一種單鏈糖蛋白。脂多糖和β2－GP1是對相互作用的蛋白，二者特異性結合后依賴Toll樣受體4信號傳導通路激活巨噬細胞的NF－κB[16]。持續激活 NF－κB可釋放大量炎癥因子[17－18]，引發細胞損傷和炎癥反應。β2－GP1可能參與了PM的炎癥與損傷肌細胞的過程。

3.2 可能參與PM＋ILD發病進程的蛋白 ZAG是一種分泌性蛋白，參與癌性惡病質的形成[19]。主要通過促進機體脂肪分解和增加產熱雙重途徑來減少體內脂肪。當小鼠患MAC16腫瘤后其ZAG分泌明顯增高，表現出明顯惡病質，體質量下降，同時脂肪含量顯著減少。本研究回顧性分析PM及PM＋ILD組患者的生化指標發現，2組患者的TC與TG水平均明顯高于對照組，且PM＋ILD組TC水平高于PM組。在本研究中，ZAG表達水平PM＋ILD組低于PM組。故推測PM合并ILD后使ZAG產生減少，同時也降低合并惡性腫瘤的可能性，與國內外學者關于PM或DM合并惡性腫瘤時再發生ILD的現象相對少見的報道一致[20]。

AHSG是一種負急性時相反應蛋白，可通過抑制炎癥細胞激活及炎癥因子的釋放達到抗炎癥的作用[21－22]。AHSG 表 達 水 平 PM＋ILD 組 低 于 PM組，提示由于AHSG的降低使得PM＋ILD組患者體內炎癥細胞激活及炎癥因子釋放的抑制作用減弱，加速ILD的進程。

A1BG是一種酸性球蛋白，在肺癌、類風濕關節炎等疾病發現過該蛋白，具體功能未知[23－24]。A1BG可能參與了PM＋ILD的進展，或是疾病的一種伴發現象。

3.3 可能參與PM及PM＋ILD疾病進展的蛋白

氧化應激參與了肺泡上皮細胞損傷和纖維化，氧化應激水平明顯升高時，抗氧化物明顯降低。當氧化與抗氧化失衡時，肺纖維化發生更為顯著[25－26]。TRF是一種體內常見的抗氧化物質。在本次研究中，蛋白組學的TRF表達水平為PM＋ILD組＜PM組＜對照組，提示TRF可能參與PM和PM＋ILD疾病的進展。但筆者對PM或DM組、PM或DM＋ILD組、SLE組、對照組用ELISA方法進行驗證，并進行組間比較，TRF在上述各組間差別均無統計學意義（P＞0.05），說明TRF與PM及PM＋ILD疾病可能無關，原因可能是樣本例數不足，有待擴大樣本量再行驗證。

目前，2－DE分離蛋白質仍存在一定的局限性[27]，主要是對低豐度蛋白質、疏水性蛋白、極度酸性或堿性蛋白、極高或極低相對分子質量等蛋白不能進行有效分離，尤其是外周血清蛋白質數量多，來源廣，蛋白質差別大，都在一定程度上限制蛋白質組學的研究。

綜上所述，TRF與PM及PM＋ILD疾病的進展可能無關，而另8種蛋白SAA、CLU、ALB、apoA－1、ZAG、AHSG、A1BG、β2－GP1等為進一步深入研究PM及PM＋ILD的致病機制提供了方向，但它們如何參與疾病的進程和具體的作用，以及是否所有的PM＋ILD、PM病例都存在相同的差異表達蛋白，仍然需要大樣本的驗證實驗來進一步明確。

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