導(dǎo)尿管球囊擴張法構(gòu)建胃食管反流病動物模型方法的改進

王強 王斌 張偉 仇明

胃食管反流病 (gastroesophageal reflux disease，GERD)發(fā)病率在我國呈增高趨勢［1］，對其發(fā)病機制的認識尚存在諸多爭議。動物模型的構(gòu)建為 GERD病 理生 理 及 治 療 效 果 研 究 提 供 了 良 好 的 工 具 。 我們 通過 球 囊 擴 張 法 獲 得 建 立 GERD 兔 模 型 的 安 全方法［2］。在此基礎(chǔ)上，我們對建模方法做了一定的改進，通過復(fù) 合 建 模 的 方 法，構(gòu) 建 兼 具 食 管 下 段 抗反流屏障缺陷和胃排空障礙的 GERD 動物模型。

資料與方法

一、一般資料

健康 5 月齡新西蘭大白兔(來自第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心)，雌雄不拘，體重 2.5 ～ 3 kg，共 12只。飼養(yǎng)于 25 ℃ 恒溫動物房。隨機分為 2 組:球囊擴張法組和復(fù)合法組，每組 6 只。

二、方法

(一)球囊擴張法建模［2］

10% 水合氯醛(3 mg /kg)腹腔麻醉。逐層切開進入腹腔，充分暴露并游離食管下段及胃食管交界區(qū)，在食管后方放置 2 條橡皮筋，標記食管下括約肌(lower esophageal sphincter，LES)的近端及遠端，向?qū)蚬軞饽覂?nèi)注入 5 ml氣體后，向外拉出氣囊直至拉不出為止，此時氣囊位于胃食管交界處。吸出氣囊氣體后，向食管內(nèi)拉入 2 ～ 3 cm，使氣囊位于 LES處，注入 5 ～ 8 ml氣體，見 LES 充分擴張，并以橡皮筋從食 管 后 方 牽 拉 食 管 以 固 定 擴 張 的 球 囊，維 持5 min，重復(fù) 2 次，每次間隔 3 min。

(二)復(fù)合法建模第一步:胃排空障礙模型的建立。

飲食不節(jié)法:兔每天喂養(yǎng)約 150 g 飼料。誘導(dǎo)時間共 3 周，每周第 1 天禁食，然后隨機無規(guī)律高脂高糖飲食且不定量。

刺激法:利用兔膽小易驚的特點，在飼養(yǎng)籠旁散養(yǎng)一只犬，使兔在 3 周喂養(yǎng)期間一直處于傷害性刺激誘導(dǎo)之下。

第二步:食管下括約肌的毀損:同球囊擴張法。

(三)食管炎建模效果評價

1．組織學(xué)檢測［2］:建模 4 周后處死動物，切取食管觀察大體變化;乙醛固定后行 H-E 染色，光鏡觀察組織學(xué)變化:食管炎指數(shù)標準分別為:肉眼:0 =正常;1 = 充血 ＞ 50% 組織;2 = 非融合性黏膜及黏膜下出血;3 = 融合性壁內(nèi)出血及糜爛。鏡下:0 = 正常;1 = 黏膜下水腫，上皮層分離或血管內(nèi)充血一項以上者;2 = 局部的壁內(nèi)出血，部分上皮脫落及炎癥表現(xiàn)一項以上者;3 = 大面積出血及上皮脫落。

2．pH 值測定［2］:pH 值測定采用荷蘭 MMS 公司 Orion 便攜式 pH 監(jiān)測儀，將導(dǎo)管電極在 pH 為7.0 及 1.0 的緩沖液中校正。開放橡皮管，置入 pH值監(jiān)測電極 10 cm 左右(位于 LES 上方 5 cm)。將pH 值監(jiān)測儀用自制腹帶固定于新西蘭大白兔背部，進行 2 h pH 值監(jiān)測。觀察 2 h 內(nèi) pH 值 ＜ 4 的時間的百分比、反流次數(shù)、持續(xù)時間超過 5 min 的反流次數(shù)及最長反流時間。

3．細胞間隙的測量［3］:切取兔食管福爾馬林固定后，按行規(guī)步驟行 H-E 染色。400 × 下拍攝照片，參照文獻［3］，以正常兔食管切片為對照，采用半定量方法評價擴張的細胞間隙增寬。分別記錄為 0:無明顯擴張;(1)輕度擴張;(2)中度擴張;(3)明顯擴張。

(四)胃動力學(xué)監(jiān)測

1．胃排空率的監(jiān)測:兔禁食 12 h，1 mg /ml美藍50 ml灌胃。30 min 后處死動物，胃內(nèi)容物以生理鹽水 50 ml收集。3 500 rpm，離心 15 min，取上清，分光光度計 640 nm 測定 OD 值。

殘留率 = 測定 OD 值 /標準 OD 值。

2．胃動力的電生理檢查［4］:兔麻醉后將一對鉑金電極植入距幽門 20 mm 的胃體漿肌層。導(dǎo)線與二導(dǎo)生理記錄儀連接，連續(xù)記錄 30 min，每 3 min 作為一個節(jié)段，記錄慢波頻率的變異系數(shù)和變異節(jié)律的指數(shù)，結(jié)果按下列公式計算。

慢波頻率變異系數(shù) (% ):慢波頻率標準差 /慢波頻率均值 × 100% ;

異常節(jié)律指數(shù) (% ):異常節(jié)律所占時間 /記錄總時間 × 100% 。

結(jié) 果

兩組動物均未見死亡，全部建模成功。按照組織學(xué)食管炎指數(shù)標準，2 組 0 ～ 3 級食管炎建模數(shù)量分別為 1 /1 /4 /0 和 0 /2 /3 /1，食管炎嚴重程度指數(shù)，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2 組間食管炎建模成功后 pH 監(jiān)測結(jié)果見表 1，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

光鏡下細胞間隙測量已成為 GERD 常用監(jiān)測指標，與正常食管黏膜相比(圖 1A)，食管炎建模后可見明顯 DIS(圖 1B)，兩組在 DIS 指數(shù)之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表 1)。

應(yīng)用復(fù)合法建模對胃排空產(chǎn)生顯著影響，較球囊擴張法胃排空率顯著降低，見表 1。

圖 1C、D 分別顯示球囊擴張法和復(fù)合法建模對胃肌電活動的影響，如表 1 所示，復(fù)合建模法組慢波頻率的變異系數(shù)和變異節(jié)律的指數(shù)均顯著高于球囊擴張組。

圖 1 1A:正常兔食管黏膜細胞間隙(H-E);1B:食管炎模型兔食管黏膜表現(xiàn)為細胞間隙增寬 (H-E);1C:球囊 擴 張法的兔肌電活動;1D:復(fù)合法建模的兔肌電活動

討 論

食管下段括約肌功能障礙和食管廓清功能減退所導(dǎo)致的食管下段抗反流屏障的破壞被認為是GERD 的主要解剖功能性原因(胃食管交界機制)，也是胃底折疊術(shù)(經(jīng)典的 Niseen 抗反流手術(shù))的功能重建的解剖學(xué)基礎(chǔ)。但隨著對 GERD 認識的深入，特別是分析難治性 GERD，即對經(jīng)典的內(nèi)科用藥質(zhì)子泵抑制劑 PPI 耐藥，或金標準腹腔鏡抗反流術(shù)療效不佳者，胃動力異常及精神因素(焦慮、抑郁)所導(dǎo)致 胃 排 空 障 礙 及 胃 腔 壓 力 增 高 (胃 機 制)對GERD 的影響越來越引起重視［5-7］，被認為是 GERD的第三大病因。針對這些病理生理特點的研究所需要的理想動物模型需具備下列特點:胃食管交界功能缺陷;胃動力異常;僅存功能性異常而解剖連續(xù)性完整。

表 1 球囊擴張法和復(fù)合法構(gòu)建胃食管反流病兔模型的結(jié)果對比

當(dāng)前 GERD 的動物模型的建立主要分為三類:(1)是直接將食管暴露于胃酸與十二指腸液［8］。優(yōu)點是建模效率高，缺點是解剖關(guān)系改變巨大，動物存活率低，不利于臨床治療，特別是手術(shù)治療等功能重建的臨床研究，該種建模方式適用于病因和病理學(xué)(主要是 Barrett食管及食管癌發(fā)生關(guān)系)研究。(2)針對于胃食管交界 處食管下括約肌功能的破壞，包括豬、狗和兔等大動物食管括約肌切斷和大鼠 等 小 型 動 物 鋼 圈 植 入 破 壞 抗 反 流 屏 障 等 方法［9-10］。該類方法最接近 GERD 的發(fā)生機制，但構(gòu)建的解剖缺陷單一，而且大多需要大型動物，費用較高。(3)通過完全或部分關(guān)閉幽門建立胃排空障礙模型，造成胃內(nèi)高壓形成反流［11-12］。缺點是過分強調(diào)胃排空障礙的解剖學(xué)改變，無法模擬功能性和精神性因素對胃動力改變及其對 GERD 發(fā)生的影響，與臨床 GERD 的功能性改變差異較大。

筆者課題組已建立食管下括約肌功能缺陷的GERD 模型［2］，其優(yōu)點是建模方法簡單而安全，成功率高。在此基礎(chǔ)上擬建立合并胃動力異常的模型。祖國傳統(tǒng)中醫(yī)研究中建立了多種胃動力障礙模型，其中藥物 /飲食刺激和情緒刺激法建立的胃動力異常模型不改變解剖關(guān)系，較好地模擬了功能性和神經(jīng)性胃動力異常［13-15］。本研究建立的模型既存在食管下段抗反流屏障缺陷，又存在胃腸動力異常所造成的胃排空延遲，同時，該模型對解剖關(guān)系改變較小，兼顧了精神因素在建模中的作用，從而提供了一種滿足臨床治療需要的更理想模型，有助于評價內(nèi)外科結(jié)合-中西醫(yī)兼顧-生理心理并重治療理念在 GERD 治療中的效果。

1 屈 坤 鵬 ，成 曉 舟 ．我 國 部 分 地 區(qū) 胃 食 管 反 流 病 患 病 率 的 meta 分析［J /CD］．中 華 胃 食 管 反流 病 電 子 雜 志，2015 ，2 (1 ):34 -44 ．

2 王 斌 ，張 偉 ，劉 晟 ，等 ．一 種 新 型 建 立 胃 食 管 反 流 病 的 動 物 模 型的 方 法 :導(dǎo) 尿 管 球 囊 擴 張 術(shù)［J /CD］．中 華 胃 食 管 反 流 病 電 子 雜志 ，2014 ，1 (1 ):52 -55 ．

3 Kandulski A，Jechorek D ，Caro C ，et al． Histomorphological differentiation of non -erosive reflux disease and functional heartburn in patients w ith PPI-refractory heartburn ［J］．Aliment Pharmacol Ther，2013 ，38 (6 ):643 -651 ．

4 魏 蘭 福 ，鄒 百 倉 ，魏 睦 新 ．莪 術(shù) 對 實 驗 性 功 能 性 消 化 不 良 大 鼠 胃排空的 影 響［J］．南 京醫(yī) 科 大 學(xué) 學(xué) 報:自 然 科 學(xué) 版 ，2003 ，23 (4 ):350 -352 ．

5 Rey E ，García-Alonso M，Moreno-Ortega M ，et al．Influence of psychological distress on characteristics of symptoms in patients with GERD :the role of IB S comorbidity［J］．Dig Dis Sci，2009 ，54 (2 ):321 -327 ．

6 Nahata M ，Muto S，Oridate N ，et al．Impaired ghrelin signaling is associated with gastrointestinal dysmotility in rats with gastroesophageal reflux disease［J］．Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2012 ，303 (1 ):G42 -53 ．

7 仇 明 ，張 偉 ．胃 排 空 障 礙 與 胃食 管 反 流 病［J /CD］．中 華 胃 食 管 反流 病 電 子 雜志 ，2015 ，2 (1 ):1 -3 ．

8 王 瑞 華 ，歐 陽 欽 ，王 立 東 ．三 種 不 同 術(shù) 式 反 流 性 食 管 炎 動 物 模 型的 建 立［J］．鄭州 大 學(xué) 學(xué) 報 :醫(yī) 學(xué) 版 ，2006 ，41 (1 ):115 -117 ．

9 徐 志 誠 ，胡 廷 澤 ，劉 文 英 ，等 ．反 流 性 食 管 炎 動 物 模 型 制 備 的 新方 法［J］．中 國修 復(fù) 重 建 外 科 雜志 ，2004 ，18 (4 ):288 -290 ．

10 Hu Y，Xu X ，Xu L ，et al．Dilated intercellular space in the larynx and esophagus of a rabbit reflux model［J］．Auris Nasus Larynx，2013 ，40 (4 ):379 -382 ．

11 鄭朝旭 ，林偉 斌 ，余俊 峰 ，等，反 流 性 食 管 炎 大 鼠 模 型 的 制 備 :不同管徑 內(nèi) 支 架 支 撐 幽 門 及 前 胃 結(jié) 扎［J］．中 國 組 織 工 程 研 究 與臨床修 復(fù) ，2010 ，14 (20 ):3705 -3708 ．

12 Asaoka D ，Nagahara A ，Oguro M ，et al．E stablishment of a reflux esophago-laryngitis model in rats［J］．Dig Dis Sci，2011 ，56 (5 ):1299 -1308 ．

13 劉晶，李 峰，唐 旭 東 ，等 ．功 能 性 消 化 不 良 動 物 模 型 及 其 在 中 醫(yī)研究中 的 應(yīng) 用 概 述［J］．環(huán) 球 中 醫(yī) 藥，2013 ，6 (12 ):955 -958 ．

14 陳晨，全 俊，李 曼 蓉 ，等 ．功 能 性 消 化 不 良 重 疊 腸 易 激 綜 合 征 動物模型 的 建 立［J］．實驗 動 物 科 學(xué) ，2013 ，30 (4 ):18 -21 ．

15 Liu LS ，Winston JH，Shenoy MM，et al．A rat model of chronic gastric sensorimotor dysfunction resulting from transient neonatal gastric irritation［J］．Gastroenterology，2008 ，134 (7 ):2070 -2079 ．

王強，王斌，張偉，等．導(dǎo)尿管球囊擴張法構(gòu)建胃食管反流病動物模型方法的改進［J/CD］．中華胃食管反流 病 電子雜志，2015，2(4):230-233．