P38與內質網應激誘導胃癌細胞順鉑耐藥的關系*

馮若 王麗萍 柴玉榮 郭文文 翟文龍

·基礎研究·

P38與內質網應激誘導胃癌細胞順鉑耐藥的關系*

馮若①王麗萍①柴玉榮①郭文文①翟文龍②

目的：探討P38在內質網應激誘導胃癌細胞中對順鉑產生耐藥的作用。方法：采用衣霉素及毒胡蘿卜素建立胃癌細胞內質網應激模型，用Western blot技術檢測內質網應激標志物GRP78的表達；流式細胞儀技術檢測內質網應激能否降低胃癌細胞對順鉑的敏感性；Western blot技術檢測內質網應激對P38激活狀態的影響；流式細胞儀技術檢測P38通路受阻能否逆轉內質網應激誘導的胃癌細胞對順鉑的耐藥現象。結果：衣霉素（或毒胡蘿卜素）處理胃癌細胞BGC823及SGC7901 8、16、24 h后，GRP78蛋白表達量均明顯高于0 h組。衣霉素（或毒胡蘿卜素）組、順鉑組及衣霉素（或毒胡蘿卜素）加順鉑組胃癌細胞系的凋亡率均明顯高于對照組（P＜0.05），衣霉素（或毒胡蘿卜素）加順鉑組凋亡率明顯低于順鉑組（P＜0.05）。衣霉素（或毒胡蘿卜素）處理胃癌細胞BGC823及SGC7901 8、16、24 h后，P38的磷酸化水平明顯高于0 h組，而各組P38蛋白表達水平無明顯變化；P38抑制劑SB203580或PD169316均可抑制P38的激活。阻斷P38通路可基本恢復內質網應激狀態下胃癌細胞對順鉑的敏感性（P＜0.05）。結論：內質網應激可通過激活P38通路誘導胃癌細胞對順鉑產生耐藥，阻斷該通路可抑制內質網應激誘導胃癌細胞對其耐藥現象。

內質網應激 胃癌細胞 P38 順鉑 耐藥

胃癌發病率在世界范圍內居惡性腫瘤發病率第二位，且發病率呈上升趨勢，發病年齡也趨于年輕化，死亡率位于我國惡性腫瘤死亡率之首［1-2］。我國胃癌患者就診時，大多已是中晚期，失去了根治性手術治療的機會，治療方案多為以化療為主的綜合治療，預后極差。雖然化療藥物可提高晚期胃癌患者的生存期，但總體療效仍不理想，其中多藥耐藥現象是導致胃癌化療失敗的主要原因。順鉑作為胃癌患者化療的一線藥物，耐藥現象嚴重，深入探討胃癌細胞對順鉑產生耐藥的機制十分必要。

內質網應激在腫瘤組織中普遍存在，可激活細胞內一系列的代償機制，對細胞發揮保護作用，可能參與耐藥機制。P38是MAPK家族的重要成員，在胃癌細胞生存、分化及增殖等方面起到重要的調控作用［3-6］。但關于內質網應激與胃癌細胞耐藥的關系及P38在內質網應激誘導胃癌細胞耐藥中的作用知之甚少。本研究擬探討內質網應激與胃癌細胞耐藥的關系，為闡明胃癌細胞的耐藥機制注入新的內容。

1 材料與方法

1.1 材料

胎牛血清與RPMI 1640培養基購自美國GIBCO公司；磷酸化P38特異性抑制劑PD169316及SB203580、衣霉素（tunicamycin，TM）及毒胡蘿卜素（thapsigargin，TG）購自美國Sigma公司；順鉑購自齊魯制藥有限公司；兔抗人GRP78抗體、HRP酶標二抗、兔抗人p-P38抗體、兔抗人P38抗體及ECL發光試劑盒購自美國CellSignaling公司；2×TaqPCRMastermix及逆轉錄試劑盒購自北京天根生物公司。TRIzol試劑及DEPC購自美國Invitrogen公司；由上海生工公司合成PCR引物。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人胃腺癌細胞系SGC7901及BGC823購自美國模式培養物集存庫（American type culture collection，ATCC）。采用RPMI 1640培養基（含10%胎牛血清）貼壁培養BGC823或SGC7901于含5%CO2、37℃飽和濕度的恒溫培養箱內。

1.2.2 內質網應激模型建立 用內質網應激誘導劑5μg/mL衣霉素或1μg/mL毒胡蘿卜素分別處理BGC823及SGC7901細胞0、8、16及24 h，Western blot檢測內質網應激標志物GRP78表達；用5 μg/mL衣霉素或1 μg/mL毒胡蘿卜素分別處理胃癌細胞BGC823及SGC7901 0 h及8 h，RT-PCR技術檢測GRP78的mRNA表達。β-actin作為內參基因，目的基因及內參基因的引物序列如下：GRP78：上游引物：5'-ATCACG CCGTCCTATGTCGC-3'；下游引物：5'-GCAATAGCAG CTGCCGTAGGCT-3'；擴增片斷長度為443bp。β-actin：上游引物：5'-TCAGAAGGATTCCTATGTGG GC-3'；下游引物：5'-CATCTCTTGCTCGAAGTCCAG-3'；擴增片斷長度為532 bp。PCR反應條件如下：94℃、3 min；30個循環（94℃、30 s；57℃、30 s；72℃、60 s）；72℃、5 min；4℃、5 min。

1.2.3 Western blot技術檢測P38及磷酸化P38的表達 用內質網應激誘導劑5 μg/mL衣霉素或1 μg/mL毒胡蘿卜素分別處理BGC823及SGC7901細胞0、8、16及24 h，Western blot技術檢測各時間點P38及磷酸化P38的表達，以明確內質網應激是否激活P38通路。將胃癌細胞BGC823及SGC7901分別分組如下：未加藥對照組、衣霉素組（5 μg/mL衣霉素孵育9 h）、SB203580或PD169316+衣霉素組（10 μg/mL SB203580或10 μg/mL PD169316預處理細胞1 h，再加5 μg/mL衣霉素繼續孵育8 h），Western blot技術檢測各組P38及p-P38的表達，以檢測磷酸化P38特異性抑制劑SB203580或PD169316對內質網應激狀態下P38通路的抑制效果。

1.2.4 流式細胞儀技術檢測內質網應激對胃癌細胞化療藥物敏感性的影響 將BGC823及SGC7901分為未加藥對照組、衣霉素組（5 μg/mL衣霉素孵育56 h）、5 μg/mL順鉑組及衣霉素+順鉑組（5 μg/mL衣霉素預處理8 h，再加5μg/mL順鉑孵育48 h），流式細胞儀技術檢測各組胃癌細胞凋亡率，以探討內質網應激是否降低胃癌細胞對順鉑的敏感性；將胃癌細胞BGC823分為未加藥對照組、10 μg/mL SB203580或10 μg/mL PD169316組、5 μg/mL衣霉素組；SB203580或PD169316+衣霉素組（10 μg/mL SB203580或10 μg/mL PD169316預處理細胞1 h，再加5 μg/mL衣霉素繼續孵育）、順鉑組（5μg/mL順鉑孵育48 h）、SB203580或PD169316+順鉑組（10 μg/mL SB203580或10 μg/mL PD169316預處理細胞1 h，再加5 μg/mL順鉑繼續孵育48 h）、衣霉素+順鉑組（5μg/mL衣霉素孵育8 h，再加 5 μg/mL順鉑繼續孵育 48 h）、SB203580或PD169316+衣霉素+順鉑組（10 μg/mL SB203580或10μg/mLPD169316預處理細胞1 h，5μg/mL衣霉素孵育8 h，再加5μg/mL順鉑繼續孵育48 h），流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率，以檢測P38通路受阻對內質網應激誘導胃癌細胞耐藥的影響。以上實驗均重復3次，數值均以x±s表示。

1.3 統計學分析

采用SPSS 10.0軟件對實驗數據進行統計學分析，采用LSD檢驗法分別進行各組間比較及組間兩兩多重比較。以α=0.05作為檢驗水準。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 衣霉素或毒胡蘿卜素誘導GRP78在胃癌細胞中的表達

Westernblot檢測顯示，與相應的0h組相比，衣霉素或毒胡蘿卜素處理胃癌細胞BGC823或SGC7901 GRP78 8、16及24 h后，GRP78蛋白表達量均明顯增高（圖1，圖2）。RT-PCR結果顯示：與相應的0 h組相比，衣霉素處理胃癌細胞BGC823或SGC7901 GRP78 8 h后，GRP78mRNA表達量明顯增高；與相應的0 h組相比，毒胡蘿卜素處理胃癌細胞BGC823或SGC7901 GRP788h后，GRP78mRNA表達量明顯增高（圖3）。

圖1 衣霉素處理胃癌細胞后GRP78的蛋白表達情況Figure 1 Protein expression of GRP78 in gastric cancer cells after tunic?amycin treatment

圖2 毒胡蘿卜素處理胃癌細胞后GRP78的蛋白表達情況Figure 2 Protein expression of GRP78 in gastric cancer cells after thapsi?gargin treatment

圖3 內質網應激誘導劑處理胃癌細胞后GRP78的mRNA表達情況Figure 3 mRNA expression of GRP78 in gastric cancer cells after ER stress-induced treatment

2.2 內質網應激降低了胃癌細胞對順鉑的敏感性

流式細胞儀結果顯示，與相應的對照組相比，各藥物處理組細胞凋亡率均明顯增高（P＜0.05）；與相應的順鉑處理組相比，衣霉素+順鉑處理組及毒胡蘿卜素+順鉑處理組凋亡率均明顯下降（P＜0.05，表1）。

表1 各組細胞凋亡率Table 1 Apoptotic rate of each group

2.3 內質網應激可在胃癌細胞BGC823中激活P38通路

Western blot結果顯示，與相應的0 h組相比，衣霉素處理BGC823或SGC7901 8、16 h及24 h后，P38的磷酸化水平均明顯增高；但各組P38蛋白表達水平則無明顯差別（圖4）。毒胡蘿卜素處理BGC823或SGC7901 8、16及24 h后，P38的磷酸化水平均亦明顯增高；且各組P38蛋白表達水平無明顯差別（圖5）。

2.4 磷酸化P38抑制劑可阻斷內質網應激狀態下胃癌細胞內P38通路的活化

Western blot結果顯示，與相應的對照組相比，衣霉素處理組BGC823的P38磷酸化水平明顯增高（P＜0.05）；而PD169316（或SB203580）+衣霉素處理組P38磷酸化水平與對照組無明顯差別（圖6）。

2.5 P38通路受阻對內質網應激誘導胃癌細胞耐藥的影響

流式細胞儀結果顯示，各藥物處理組細胞凋亡率均明顯高于對照組（P＜0.05）；SB203580+順鉑處理組細胞凋亡率明顯高于SB203580處理組（P＜0.05），但SB203580與順鉑并無協同效應（P＞0.05）；衣霉素+順鉑處理組細胞凋亡率明顯低于順鉑處理組（P＜0.05）；SB203580+衣霉素+順鉑處理組細胞凋亡率明顯高于衣霉素+順鉑處理組（P＜0.05），但與順鉑處理組無明顯差別（P＞0.05，圖7）。

將磷酸化P38抑制劑SB203580換為PD169316，結果與SB203580相似。即各藥物處理組細胞凋亡率均明顯高于對照組（P＜0.05）；PD169316+順鉑處理組細胞凋亡率明顯高于PD169316處理組（P＜0.05），但PD169316與順鉑并無協同效應（P＞0.05）；衣霉素+順鉑處理組細胞凋亡率明顯低于順鉑處理組（P＜0.05）；PD169316+衣霉素+順鉑處理組細胞凋亡率明顯高于衣霉素+順鉑處理組（P＜0.05），但與順鉑處理組無明顯差別（P＞0.05，圖7）。

圖4 衣霉素處理胃癌細胞不同時間后P38磷酸化狀態的改變Figure 4 Phosphorylation changes of P38 in gastric cancer cells after tu?nicamycin treatment for different periods

圖5 毒胡蘿卜素素處理胃癌細胞不同時間后P38磷酸化狀態的改變Figure 5 Phosphorylation changes of P38 in gastric cancer cells after thapsigargin treatment for different periods

圖6 磷酸化P38抑制劑對內質網應激狀態下BGC823細胞內P38活性的影響Figure 6 Inhibition effects of phospho-P38 inhibitors on P38 activity in BGC823 gastric cancer cells upon ER stress

圖7 各組細胞凋亡率Figure 7 Apoptotic rate of each group

3 討論

中晚期胃癌患者5年生存率的關鍵在于如何改善胃癌細胞多藥耐藥現象以提高胃癌細胞對化療藥物的敏感性［7-8］。為此，國內外學者從不同角度探討了胃癌多藥耐藥機制。但關于胃癌細胞自身的生長環境與生長狀態與其對藥物的敏感性關系的研究則鮮有報道。研究發現內質網應激在腫瘤組織內普遍存在，而內質網應激狀態下，腫瘤細胞對化療藥物敏感性明顯降低，表明內質網應激可能是腫瘤細胞產生多藥耐藥的重要誘因［9］。

當某些因素擾亂蛋白質折疊時，可導致未折疊的蛋白質堆積于內質網腔內，為消除或緩解內質網腔內的未折疊蛋白質的堆積狀態，細胞會產生一系列代償性自我保護反應，該反應稱為未折疊蛋白質反應或內質網應激反應。內質網應激可通過XBP1激活PI3K/Akt通路，引發黑色素瘤細胞對化療藥物產生耐藥［10］。大多數黑色素瘤組織內Braf通路均處于激活狀態，常被看作有效的藥物治療靶點，而內質網應激可誘導黑色素瘤細胞發生自我保護性自噬現象，致使黑色素瘤細胞對Braf抑制劑產生耐藥［11］。

除此之外，在乳腺癌、膠質瘤及肝癌等多種腫瘤中也證實了內質網應激可誘導細胞耐藥［12-14］。而關于內質網應激在胃癌細胞化療耐藥中的作用則未見報道。

Zhang等［15］研究發現內質網應激誘導胃癌細胞發生的凋亡率很低，其主要原因在于內質網應激狀態下，胃癌細胞可激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-acti?vated protein kinase，MAPK）等通路，并可上調癌基因如Bcl-2等的表達，提示內質網應激對胃癌細胞起到重要的保護作用。作為細胞的自我保護性反應，內質網應激反應與胃癌細胞耐藥的關系值得關注。

本研究采用了N-糖鏈抑制劑衣霉素通過干擾蛋白質的糖基化來誘導胃癌細胞發生內質網應激反應。分子伴侶葡萄糖調節蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）在內質網應激狀態下表達量顯著增強。而GRP78高表達常作為檢測內質網應激存在的指標。本實驗結果表明衣霉素處理兩種不同的胃癌細胞系后，GRP78的表達量均顯著提高，提示衣霉素可誘導胃癌細胞發生內質網應激。本研究還選用了另一種內質網應激誘導劑毒胡蘿卜素，通過干擾細胞內鈣離子平衡誘發內質網應激，借以消除單一內質網應激誘導劑的偏靶效應。結果與衣霉素相似，毒胡蘿卜素可致兩種不同的胃癌細胞系中GRP78的表達量顯著增加，誘發其發生內質網應激。本研究發現內質網應激狀態下，兩種不同分化程度的胃癌細胞系對化療藥物順鉑的敏感性均明顯下降，提示內質網應激誘導胃癌細胞對順鉑產生耐藥。

內質網應激可激活細胞的生存或增殖通路，起到保護細胞的作用。在內皮細胞及成纖維細胞等多種類型的細胞中，內質網應激均可激活P38絲裂原活化蛋白激酶通路［16-18］。P38亦參與調控胃癌細胞的生存、增殖及分化等生物學活動。因此，P38通路可能與內質網應激降低胃癌細胞對化療藥物的敏感性有關。本研究結果顯示內質網應激可激活胃癌細胞內P38通路。為揭示P38在內質網應激誘導胃癌細胞耐藥中的作用并避免單一小分子抑制劑的偏靶效應，本研究采用兩種結構不同的磷酸化P38特異性抑制劑SB203580和PD169316來阻斷該通路，結果顯示這兩種抑制劑均能有效阻斷內質網應激誘導P38通路的激活，且該通路受阻則可基本逆轉內質網應激誘導胃癌細胞對順鉑的耐藥現象，提示內質網應激可通過激活P38通路誘導胃癌細胞對順鉑產生耐藥。

內質網應激借助三種內質網應激感受蛋白IRE1、ATF6及PERK來啟動一系列自我保護反應，來維持細胞的生存狀態。其中內質網應激可經IRE1通路激活PI3/Akt，進而誘導黑色素瘤細胞產生耐藥；內質網應激則主要通過ATF6通路來調控視網膜母細胞瘤的生存狀態［10］；對于神經膠質瘤來說，PERK在調控內質網應激介導其對化療藥物敏感性方面發揮重要作用［13］。這些研究表明不同細胞類型或不同因素誘導下，內質網應激可借助不同的啟動蛋白參與調控細胞耐藥。但關于內質網應激感受蛋白與胃癌細胞內P38激活之間的關系，以及P38與其他生存通路之間的關系還有待于深入探討。

[1]Ding S,Wang L.Value the standardization of gastric cancer pathogenesis[J].Natl Med J China,2013,93(16):1201-1202.[丁士剛,王 麗.應重視胃癌發病機制的規范研究[J].中華醫學雜志, 2013,93(16):1201-1202.]

[2]Carcas LP.Gastric cancer review[J].J Carcinog,2014,13:14.

[3]Koul HK,Pal M,Kou S.Role of p38 MAP Kinase Signal Trans?duction in Solid Tumors[J].Genes Cancer,2013,4(9-10):342-359.

[4]Kim IK,Park SM,Cho HJ,et al.14-3-3σ attenuates RhoGDI2-induced cisplatin resistance through activation of Erk and p38 in gastric cancer cells[J].Oncotarget.2013,4(11):2045-2056.

[5]Souma Y,Nishida T,Serada S,et al.Antiproliferative effect of SOCS-1 through the suppression of STAT3 and p38 MAPK acti?vation in gastric cancer cells[J].Int J Cancer.2012,131(6):1287-1296.

[6]Graziosi L,Mencarelli A,Santorelli C,et al.Mechanistic role of p38 MAPK in gastric cancer dissemination in a rodent model peri?toneal metastasis[J].Eur J Pharmacol,2012,674(2-3):143-152.

[7]Yu L.Advances in the study of the mechanism of multidrug resis?tance in gastric cancer[J].Acta Universitatis Medicinalis Anhui, 2013,48(4):449-452.[喻龍姍.胃癌多藥耐藥機制研究進展[J].安徽醫科大學學報,2013,48(4):449-452.]

[8]Kim HK,Choi IJ,Kim CG,et al.A Gene Expression Signature of Acquired Chemoresistance to Cisplatin and Fluorouracil Combi?nation Chemotherapy in Gastric Cancer Patients[J].PLoS One, 2011,6(2):e16694.

[9]Luo B,Lee AS.The critical roles of endoplasmic reticulum chaper?ones and unfolded protein response in tumorigenesis and anticancer therapies[J].Oncogene,2013,32(7):805-818.

[10]Jiang CC,Yang F,Thorne RF,et al.Human melanoma cells un?der endoplasmic reticulum stress acquire resistance to microtu?bule-targeting drugs through XBP1-mediated activation of Akt [J].Neoplasia,2009,11(5):436-447.

[11]Ma XH,Piao SF,Dey S,et al.Targeting ER stress-induced au?tophagy overcomes BRAF inhibitor resistance in melanoma[J].J Clin Invest,2014,124(3):1406-1417.

[12]Parmar JH,Cook KL,Shajahan-Haq AN,et al.Modelling the ef?fect of GRP78 on anti-oestrogen sensitivity and resistance in breast cancer[J].Interface Focus,2013,3(4):20130012.

[13]Epple LM,Dodd RD,Merz AL,et al.Induction of the Unfolded Protein Response Drives Enhanced Metabolism and Chemoresis?tance in Glioma Cells[J].PLoS One,2013,8(8):e73267.

[14]Zhai W,Ye J,Li R,et al.Endoplasmic reticulum stress-induced human chemoresistance to adrimycin in hepatocellular cancer cells[J].Chin J Exp Surg,2014,31(9):1936-1938.[翟文龍,葉健文,李仁鋒,等.內質網應激誘導人肝癌細胞對阿霉素產生耐藥的研究[J].中華實驗外科雜志,2014,31(9):1936-1938.]

[15]Zhang LJ,Chen S,Wu P,et al.Inhibition of MEK blocks GRP78 up-regulation and enhances apoptosis induced by ER stress in gastric cancer cells[J].Cancer Letters,2009,274(1):40-46.

[16]Galán M,Kassan M,Kadowitz PJ,et al.Mechanism of endoplas?mic reticulum stress-induced vascular endothelial dysfunction[J]. Biochim Biophys Acta,2014,1843(6):1063-1075.

[17]Shimada Y,Kobayashi H,Kawagoe S,et al.Endoplasmic reticu?lum stress induces autophagy through activation of p38 MAPK in fibroblasts from Pompe disease patients carrying c.546G＞T mutation[J].Mol Genet Metab,2011,104(4):566-573.

[18]Huang C,Wang JJ,Ma JH,et al.Activation of the UPR Protects against Cigarette Smoke-induced RPE Apoptosis through Up-Regulation of Nrf2[J].J Biol Chem,2015,290(9):5367-5380.

（2015-05-06收稿）

（2015-06-16修回）

（編輯：鄭莉）

Role of P38 in endoplasmic reticulum stress-induced chemoresistance to cisplatin in gastric cancer cells

Ruo FENG1,Liping WANG1,Yurong CHAI1,Wenwen GUO1,Wenlong ZHAI2
1Department of Histology and Embryology,Medical College of Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,China;2Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery,the FirstAffiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450052,China.
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81401995)and the Basic and Advanced Technology Research of Henan(No.132300410109).

Wenlong ZHAI;E-mail:zhai-wl@hotmail.com

Objective:To investigate the mechanism of endoplasmic reticulum(ER)stress-induced chemoresistance to cisplatin in gastric cancer cells.Methods:ER stress models were established in both BGC823 and SGC7901 gastric cancer cells.The expression of GRP78,an ER stress marker,was examined by Western blot analysis.Moreover,whether ER stress can decrease the sensitivity of gastric cancer cells to cisplatin and activate P38 was explored by flow cytometry and Western blot analysis,respectively.Whether ER stress-induced chemoresistance to cisplatin can be abrogated by blocking P38 activity in gastric cancer was also elucidated using flow cytometry.Results:GRP78 protein expression markedly increased after treating BGC823 and SGC7901 gastric cancer cells with tunicamycin(TM)or thapsigargin(TG)for 8,16,and 24 h(P＜0.05),compared with that in the group treated for 0 h.The apoptotic rates of TM-(or TG)-,cisplatin-,and TM(or TG)plus cisplatin-treated groups significantly increased(P＜0.05)in both BGC823 and SGC7901 gastric cancer cells compared with the rate in the control group.The apoptotic rate of TM(or TG)plus cisplatin-treated group significantly decreased(P＜0.05)in both BGC823 and SGC7901 gastric cancer cells compared with that of the cisplatin-treated group.Compared with the group treated for 0 h,phospho-P38 expression markedly increased after treating BGC823 and SGC7901 gastric cancer cells with TM(or TG)for 8,16,and 24 h(P＜0.05).No difference in P38 protein expression was observed between each group in both BGC823 and SGC7901 gastric cancer cells(P＞0.05).Both P38 inhibitors,either SB203580 or PD169316,can inhibit the activation of P38.The inhibition of P38 activity can overcome ER stress-induced chemoresistance to cisplatin in gastric cancer cells(P＜0.05).Conclusion:ER stress can trigger the chemoresistance to cisplatin by activating P38 in gastric cancer cells.

endoplasmic reticulum stress,gastric cancer cell,P38,cisplatin,chemoresistance

10.3969/j.issn.1000-8179.20150508

①鄭州大學基礎醫學院組織學與胚胎學教研室（鄭州市450001）；②鄭州大學第一附屬醫院肝膽外科

*本文課題受國家自然科學基金項目（編號：81401995）和河南省基礎與前沿技術研究項目（編號：132300410109）資助

翟文龍 zhai-wl@hotmail.com

馮若 專業方向為消化系統腫瘤基礎研究。

E-mail：fr@zzu.edu.cn