黃玉米粗類黃酮提取工藝正交試驗優化及其體外抗氧化活性

楊文平，李 云，郝教敏,*，楊珍平*，楊 華，朱迎春

（1.河北聯合大學生命科學學院，河北 唐山 063000；2.山西農業大學食品科學與工程學院，山西 太谷 030801；3.山西農業大學農學院，山西 太谷 030801）

黃玉米粗類黃酮提取工藝正交試驗優化及其體外抗氧化活性

楊文平1，李 云2，郝教敏2,*，楊珍平3,*，楊 華2，朱迎春2

（1.河北聯合大學生命科學學院，河北 唐山 063000；2.山西農業大學食品科學與工程學院，山西 太谷 030801；3.山西農業大學農學院，山西 太谷 030801）

以黃玉米紀元1號為材料，采用單因素試驗與三元二次正交試驗，考察乙醇體積分數、料液比、浸提溫度及浸提時間對粗類黃酮提取量的影響及黃玉米粗類黃酮清除1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和·OH的能力。得出最優工藝參數為料液比1∶35.5（g/mL）、69 ℃浸提1.85 h，此條件下粗類黃酮提取量為85.88 mg/g。當粗類黃酮質量濃度為20 mg/mL時，對DPPH自由基和·OH的清除率分別為76.47%和32.62%，分別相當于蘆丁標準品（0.1、0.2 mg/mL）清除能力的81%～84%和40%～50%。黃玉米粗類黃酮對DPPH自由基的清除率明顯大于對· OH的清除率，且隨質量濃度提高，清除率顯著提高（P＜0.05）。

黃玉米；粗類黃酮；提取條件；抗氧化活性

植物類黃酮是植物多酚的亞類，具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂質過氧化活性等抗氧化能力，是一種天然抗氧化劑，能夠預防多種由氧化損傷導致的疾病，包括癌癥、心血管疾病、骨質疏松癥、糖尿病以及神經退行性疾病[1]，對體內能量代謝也有一定的作用[2]。O2－·和·OH等活性氧自由基誘導的氧化損傷一直被認為是引起衰老、細胞損傷、死亡和組織傷害、細胞癌變的原因之一[3]。因此尋找高效、低毒的抗氧化劑一直是近年來研究者們關注的課題。已有研究曾對玉米多酚類化合物[4-5]、玉米抗氧化肽[6-8]、玉米胚芽脫脂粕酶解產物[9]、玉米胚芽蛋白水解物[10]、玉米醇溶蛋白[11]、真菌固態發酵玉米[12]、黑玉米和黃玉米抗氧化提取物[13]等的抗氧化性進行了研究。本研究擬對“紀元1號”黃玉米粉的粗類黃酮提取條件及抗氧化性進行研究，并比較最佳工藝條件下獲得的粗類黃酮對1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基及·OH的清除能力，為拓寬玉米深加工途徑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紀元1號玉米（Zea mays L.） 山西省應縣種子公司。籽粒黃色，經近紅外谷物品質分析儀檢測，籽粒水分含量11.23%、粗蛋白含量9.68%、粗脂肪含量3.96%、賴氨酸含量0.26%、粗淀粉含量74.21%、容質量755 g/L。

無水乙醇 天津市化學試劑三廠；DPPH 美國Sigma公司；30%雙氧水 北京北化精細化學品有限公司；水楊酸 國藥集團化學試劑有限公司；上述試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FZ102型微型植物粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；TDA-8002電熱恒溫水浴鍋 北京化玻聯醫療器械有限公司；M287702型真空抽濾設備 北京中西遠大科技有限公司；WFJ2100型可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；SHZ-Ⅲ型循環水真空泵、RE-52A 旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；SK-1快速混勻器 常州潤華電器有限公司；INFRA TEC TM 1241近紅外谷物品質分析儀 瑞典Foss公司。

1.3 方法

1.3.1 蘆丁標準曲線的繪制

[14]，得到標準曲線的線性回歸方程y=0.173 9x＋0.002 2（R2=0.997 6）。

1.3.2 粗類黃酮的提取和測定

采用分光光度比色法。將風干的黃玉米籽粒粉碎過篩后，獲得全玉米粉。準確稱取該玉米粉2 g于150 mL燒瓶中，加入一定體積分數一定劑量的乙醇溶液，封口，搖勻，置于恒溫水浴鍋水浴浸提一定時間，過濾。取濾液1 mL置于25 mL容量瓶中，按照1.3.1節標準曲線的測定方法，用30%乙醇溶液補至10 mL，加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，振搖，放置5 min，再加入1 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻后放置6 min，再加入5 mL 1mol/L氫氧化鈉溶液，用30%乙醇定容至刻度線，搖勻，靜置15 min，于510 nm波長處測定提取液的吸光度，并根據標準曲線的線性回歸方程計算粗類黃酮提取量，見式（1）[15]。

1.3.3 粗類黃酮提取的試驗設計優化

設乙醇體積分數、料液比（黃玉米粉-乙醇溶液，g/mL）、浸提溫度及浸提時間4 個單因素試驗（表1）。根據單因素試驗結果，確定3 個主要影響因素，采用三元二次正交回歸設計優化提取工藝，正交因素水平見表2。

表1 單因素試驗Table1 Single factor experiments

表2 三因素二次正交設計因素與水平Table2 Factors and their coded levels used in quadratic rotation orthogonal composite design

1.3.4 黃玉米粗類黃酮體外抗氧化能力的測定

準確稱取一定質量的全玉米粉置于平底燒瓶中，按照最佳提取工藝進行冷凝回流浸提。將浸提液過濾，再次提取，合并濾液置于旋轉蒸發儀中進行減壓濃縮，將濾液濃縮至原體積的1/4左右，加入4 倍體積的95%乙醇溶液，在4 ℃條件下過夜靜置，然后抽濾，自然干燥，即得粗類黃酮粉。自由基清除實驗均以蘆丁標準品溶液（0.1 mg/mL和0.2 mg/mL）為陽性對照。

1.3.4.1 黃玉米粗類黃酮清除DPPH自由基能力測定

參照Yamaguchi等[16]的報道并適當改進。將粗類黃酮粉用甲醇溶解，配成20 mg/mL溶液，并作梯度稀釋。DPPH溶液濃度為0.25 mmol/L。在試管中分別加入0.5 mL待測液和0.5 mL DPPH溶液，充分振搖后放于暗處在室溫條件下反應30 min，然后于517 nm波長處測定吸光度。用0.5 mL待測液加等體積的甲醇（空白溶劑）作樣品對照，用0.5 mL DPPH溶液加等體積的甲醇作空白對照，測定時用純甲醇調零。按照式（2）計算樣品對DPPH自由基的清除能力。

式中：Ai為樣液與DPPH混合液的吸光度；Aj為樣液與空白溶劑混合液的吸光度；Ac為DPPH與空白溶劑混合液的吸光度。

1.3.4.2 黃玉米粗類黃酮清除·OH能力測定

采用H2O2/Fe2＋體系-水楊酸捕獲法，參照吳亞楠等[17]的報道并適當改進。將粗類黃酮粉用60%乙醇溶液溶解，配成20 mg/mL溶液，并作梯度稀釋。在試管中依次加入6 mmol/L FeSO4溶液2 mL，待測液2 mL，6 mmol/L H2O2溶液2 mL，搖勻，靜置10 min，接著加入6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液2 mL，搖勻，放入37 ℃水浴鍋中加熱30 min后取出，于510 nm波長處測其吸光度；另取2支試管，分別做空白和樣品對照，測定時用蒸餾水調零。按式（3）計算各待測樣品對·OH的清除率。

式中：Ai為樣液與FeSO4、H2O2、水楊酸溶液混合液的吸光度；Aj為樣液與空白溶劑（FeSO4、H2O2溶液）混合液的吸光度；Ac為水楊酸溶液與空白溶劑混合液的吸光度。

1.4 數據分析

對所得數據用Excel數理統計分析軟件整理制表，用Sigma Plot 10.0繪制單因素曲線圖，并采用SAS 9.1.3統計分析軟件進行方差分析與Duncan’s多重比較、RSREG回歸分析、G3D響應面繪圖分析和GCONTOUR等高線繪圖分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

圖1 乙醇體積分數（A）、料液比（B）、浸提溫度（C）、浸提時間（D）對黃玉米粗類黃酮提取量的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration (A), solid/solvent ratio (B), extraction temperature (C) and extraction time (D) on the yield of fl avonoids from yellow maize

由圖1A可知，95%乙醇溶液的粗類黃酮提取量最高（P＜0.05），而無水乙醇的粗類黃酮提取量急劇降低，可能由于無水乙醇更易使一些醇溶性雜質及親脂性成分溶出，從而降低粗類黃酮提取量。由于玉米粉中含有較高含量的淀粉，因此適當提高溶劑用量（圖1B），可以減輕浸提過程中的糊化現象，獲得較高的粗類黃酮提取量；當料液比達到1∶30～1∶35時，粗類黃酮提取量趨于穩定，說明玉米粉中的粗類黃酮已完全溶出。由圖1C、D可知，浸提溫度低于65 ℃或浸提時間低于2 h，都明顯影響玉米粉粗類黃酮的充分溶出；而溫度過高或時間過長，又可能會破壞粗類黃酮的活性結構或因乙醇溶液蒸發速率加快而導致糊化，進而降低粗類黃酮提取量；尤其浸提時間長達3.5 h時，粗類黃酮提取量急劇下降（P＜0.05）。綜合以上單因素試驗結果，選擇95%乙醇溶液、料液比1∶35、65 ℃浸提2 h，可以獲得較高的粗類黃酮提取量。

2.2 正交試驗結果及其方差分析

采用三元二次正交設計，分析料液比（X1）、浸提溫度（X2）、浸提時間（X3）及其交互作用對黃玉米粗類黃酮提取量的影響，并獲得最佳提取工藝。正交試驗結果見表3。

采用SAS軟件RSREG過程對表3三因素水平與粗類黃酮提取量指標進行的回歸分析，得粗類黃酮提取量對試驗因素X1～X3的回歸方程：Y=85.08＋2.51X1＋3.07X2＋0.22X3－0.02X1X2＋0.38X1X3－2.82X2X3－

表3 三因素二次正交設計及結果（n=6）Table3 Three-factor quadratic rotation orthogonal composite design with experimental results (n=6)

表4 回歸模型及主效應的方差分析Table4 Analysis variance of the regression model and main effects

對回歸模型進行方差分析與F檢驗（表4）可知，F=18.41（P=0.001 0），達到高度顯著水平；回歸方程的決定系數R2=0.965 1，說明模型方程差異顯著，且擬合較好。因此可以用該模型分析各工藝參數對粗類黃酮提取量的影響。料液比、浸提溫度對粗類黃酮提取量的影響均達到P＜0.01極顯著水平，浸提時間的主效應不顯著。這主要是由于黃酮類化合物屬于次生代謝物質，通常存在于植物細胞的胞基質及液泡中，其向溶劑擴散要克服細胞膜的阻力，同時也受到原料內其他物質的干擾，因此料液比多少決定粗類黃酮物質能否充分溶出，是否會發生淀粉糊化現象；浸提溫度高低決定溶出速率快慢、溶劑揮發程度及粗類黃酮結構是否破壞，同時也影響淀粉糊化及蛋白質變性等；浸提時間長短只影響粗類黃酮及其他醇溶性物質的溶出程度。

對回歸模型的偏回歸系數進行顯著性檢驗（表5）表明，料液比、浸提溫度、浸提時間的二次項均為負效應，且|B11|（P＜0.001）＞|B22|（P＜0.01）＞|B33|（P＞0.05）；一次項均為正效應，|B2|（P＜0.01）＞|B1|（P＜0.01）＞|B3|（P＞0.05）；交互項|B32|＞|B31|＞|B21|，除B32達到了極顯著（P＜0.01）水平外，其余交互效應不顯著。

表5 參數的顯著性檢驗Table5 Test of parameter estimates

采用降維法將模型方程中的料液比（X1）固定在0水平，獲得粗類黃酮提取量與浸提溫度（X2）和浸提時間（X3）的偏回歸模型：

Y=85.08＋3.07X2＋0.22X3－2.82X2X3－4.69X22－

根據上述偏回歸模型，利用SAS軟件的G3D過程，繪制互作響應面三維圖（圖2），可以看出因素影響大小為浸提溫度＞浸提時間。當X2、X3分別在0.365（69 ℃）、－0.319（1.83 h）水平時，響應值最大85.72 mg/g；隨X2、X3分別從－1.215提高到0.365、－0.319時，Y值增大，二者協同；隨X2、X3分別從0.365、－0.319提高到1.215時，響應值減小，二者拮抗。出現上述結果的原因如前所述，浸提溫度高低更易影響玉米粉粗類黃酮的結構穩定性與溶出速率，同時還影響溶劑揮發程度，進而產生淀粉糊化或蛋白質變性等；而浸提時間長短只影響粗類黃酮及其他醇溶性物質的溶出程度。需要特別指出的是玉米粗類黃酮具有較高的溫度穩定性，最佳提取溫度可達到69 ℃。由SAS軟件RSREG過程中3個因素典型性分析結果可知，當料液比（X1）、浸提溫度（X2）、浸提時間（X3）分別為1∶35.5（對應編碼值0.128）、69 ℃（對應編碼值0.357）、1.85 h（對應編碼值－0.291）時，粗類黃酮提取量最大85.91 mg/g。經實測驗證該最佳工藝的提取量為85.88 mg/g，標準偏差為0.02 mg/g。所以該模型較好地反映了各因素對黃玉米籽粒粗類黃酮提取量的影響。

圖2 浸提溫度（X2）和浸提時間（X3）交互作用的響應面圖Fig.2 Response surface plots showing the effects of extractiontemperature (X2) and time (X3) on extraction effi ciency

2.3 黃玉米粗類黃酮的體外清除自由基效果分析

表6 黃玉米粗類黃酮對自由基的清除能力Table6 Scavenging rates of yellow maize fl avonoids toward DPPH and hydroxyl radicals %

由表6可知，當黃玉米粗類黃酮質量濃度較低（1.25 mg/mL）時，對DPPH自由基和·OH的清除能力均較差（分別為11.08%和6.01%）；當黃玉米粗類黃酮質量濃度增大到2.5 mg/mL，對DPPH自由基的清除率明顯提高，達到21.69%（P＜0.05），而對·OH的清除率（6.56%）沒有顯著變化（P＞0.05）；繼續增大黃玉米粗類黃酮質量濃度，對兩種自由基的清除率均明顯增強（P＜0.05），且對DPPH自由基的清除率增加幅度更大；當黃玉米粗類黃酮質量濃度達到20 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率達到76.47%，對·OH的清除率達到32.62%，分別相當于對照蘆丁標準品清除能力的81%～84%、40%～50%，且對DPPH自由基的清除率是對·OH的清除率的2倍以上。將清除率與粗類黃酮質量濃度進行回歸擬合，回歸方程分別為Y=8.902 7X＋0.498 5（R2=0.999 8，DPPH自由基），Y=1.433 9X＋3.935 5（R2=0.995 8，·OH），擬合程度均達到99%以上。結果表明，黃玉米粗類黃酮具有較強的清除自由基能力，且對DPPH自由基的清除效果強于對·OH的清除效果。

3 結 論

黃玉米粗類黃酮水浴醇提取的最佳工藝為：乙醇體積分數、料液比、浸提溫度和浸提時間分別為95%、1∶35.5、69 ℃和1.85 h。此條件下粗類黃酮提取量為85.91 mg/g，經實測驗證該最佳工藝的粗類黃酮提取量為85.88 mg/g，標準偏差為0.02 mg/g。黃玉米粗類黃酮具有較強的清除自由基能力，隨質量濃度提高，清除自由基能力顯著增強（P＜0.05）；在同一質量濃度條件下，對DPPH自由基的清除率明顯大于對·OH的清除率。

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Optimization of Extraction Conditions for Flavonoids from Yellow Maize and Their Antioxidant Activity in Vitro

YANG Wenping1, LI Yun2, HAO Jiaomin2,*, YANG Zhenping3,*, YANG Hua2, ZHU Yingchun2
(1. College of Life Science, Hebei United University, Tangshan 063000, China; 2. College of Food Science and Engineering, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China; 3. College of Agriculture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China)

Single-factor experiments combined with three-factor quadratic rotation orthogonal composite design were adopted to analyze the effects of ethanol concentration, solid to solvent ratio, extraction temperature, and extraction time on the yield of flavonoids from yellow maize (Zea mays Jiyuan 1) and the radical scavenging abilities of the extracted fl avonoids against 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) and hydroxyl radicals (·OH) in vitro. The results indicated that the optimum parameters for extracting fl avonoids were found to be extraction at 69 ℃ for 1.85 h with a solid/liquid ratio of 1:35.5 (g/mL). The yield of fl avonoids was 85.88 mg/g under the optimized conditions. The scavenging rates of 20 mg/mL yellow maize fl avonoids against DPPH and hydroxyl radicals were 76.47% and 32.62%, respectively, which were equivalent to 81%-84% and 40%-50% as compared to rutin (0.1 and 0.2 mg/mL, respectively). The yellow maize fl avonoids showed more powerful scavenging activities against DPPH radical than against hydroxyl radical, which increased signifi cantly with increasing fl avonoid concentrations.

yellow maize (Zea mays L.); fl avonoids; extraction conditions; antioxidant activity

S513

A

1002-6630（2015）20-0062-05

10.7506/spkx1002-6630-201520011

2015-02-03

山西農業大學育種基金項目（2014yz2-8）；國家自然科學基金青年科學基金項目（31101113）

楊文平（1971—），女，副教授，博士，主要從事天然植物抗氧化物質提取及應用研究。

E-mail：yangwenping518@163.com

*通信作者：郝教敏（1974—），男，副教授，碩士，主要從事天然植物抗氧化物質在肉制品中開發利用研究。

E-mail：haojm.1@163.com

楊珍平（1973—），女，教授，博士，主要從事植物資源學及天然植物開發利用研究。E-mail：yangzp.2@163.com