響應面試驗優化香根草油的超臨界CO2萃取工藝及其萃取物分析

廖耀華，王 丹，王寶慶，劉振鋒，任保增,*，王宏力

（1.鄭州大學化工與能源學院，河南 鄭州 450001；2.河南省化工研究所有限責任公司，河南 鄭州 450052）

響應面試驗優化香根草油的超臨界CO2萃取工藝及其萃取物分析

廖耀華1，王 丹1，王寶慶1，劉振鋒1，任保增1,*，王宏力2

（1.鄭州大學化工與能源學院，河南 鄭州 450001；2.河南省化工研究所有限責任公司，河南 鄭州 450052）

以新鮮香根草根須為原料，通過單因素試驗研究粒徑、裝料系數、萃取壓力、萃取溫度、CO2流率及萃取時間對超臨界CO2萃提香根草油得率的影響。在此基礎上，選取萃取壓力、萃取溫度和CO2流率為影響因素，以香根草油得率為響應值，采用Box-Behnken方法設計試驗，進行響應面分析。結果表 明：超臨界CO2萃取香根草油的適宜工藝參數為粒徑范圍60～80目、裝料系數0.8、萃取壓力22.61 MPa、萃取溫度35.41 ℃、CO2流率1.65 L/min、萃取時間1.5 h。在此條件下預測香根草油得率達到7.780%，實驗驗證值為7.762%，與預測一致。采用氣 相色譜-質譜法對超臨界萃取的香根草油進行了成分分析，鑒定出18 種化合物，占總萃取物的69.88%。其中主要成分為柏木烯醇、脫氫香橙烯、月桂烯酮以及香根草特有的香根醇、香根酮等化合物，并按照應用領域對其進行了分類總結。

超臨界CO2萃取；香根草油；響應面法；氣相色譜-質譜法

香根草（Vetiveria zizanioides），又名巖蘭草，是一種多年生禾本科巖蘭草屬植物，主要分布在一些亞熱帶國家和我國南方地區[1]，是自然界根系最長的草本植物，被稱為“神奇之草”[2]。香根草是一種優良的經濟作物，例如河南省南陽市將香根草引進長江以北地區，用于水土保持、污水凈化、綜合開發等，以改造生態，并創造經濟效益，顯現出了較好的效果。商品香根草種植采用間隔輪伐方式，既起到了保持水土的作用，每年又可以生產數萬噸香根草原料資源。因此，香根草的綜合開發利用具有重要的現實意義。

香根草根部富含巖蘭草醇、萜烯類和一些倍半萜（烯）類的化合物，經蒸餾或者萃取得到的香根草油具有一定的食用、殺蟲、滅菌、以及藥用保健功能等[3]，是食品添加劑、香精、化妝品工業的重要原料。目前，較為傳統的蒸餾和有機溶劑法是香根草油的主要提取方法。朱自仁等[4]采用常規有機溶劑浸提法制得了香根油浸膏，該工藝產品僅為浸膏，所含蠟質等雜質較多且并未取出，缺乏檢測手段。龔德慎等[5]對貴州地區原產的香根草用水蒸氣長時間蒸餾12 h左右，后用石油醚回收產品，得油率僅為0.8%，未對水蒸氣蒸餾法進行工藝優化，得率低，原料消耗量大，未能工業推廣。文媛等[6]利用微波萃取原理來破壞植物細胞結構，達到縮短萃取時間的目的，并進行了有機溶劑的篩選。使萃取率有了一定程度的提高，并對該方法的產品進行了化學成分分析測定，但萃取率依然處于較低水平。Talansier等[7]進行了乙醇作夾帶劑時壓力對超臨界CO2萃取香根草油收率的初步動力學研究，進行了動力學模型的優選。但僅計算了在單一萃取條件下（40 ℃、200 Bar）的一些動力學參數，缺乏普適性。Filippi等[8]利用氣相色譜和氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯用分析儀等對市售不同產地香根草油的主要成分進行了較為系統的鑒定，但僅列出了成分表，缺乏分析與總結。

本實驗以人工種植的香根草為研究對象，在充分考察單因素影響的條件下，選用Box-Behnken試驗設計對其進行了超臨界CO2萃提研究并進行相關分析，尋找并確定了萃取的最佳工藝參數，分析了萃取物的主要成分，以期為香根草相關產品的開發研究提供一些可靠的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮香根草根須產自河南南陽；CO2（食品級，純度＞99.9%） 鄭州市科益工業氣體公司；無水乙醇（優級純） 天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Spe-ed SFE Helix超臨界萃取系統 美國Applied Separations公司；DHG-9070A型電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；FZ102型微型植物粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；JY302型電子天平 上海浦春計量儀器有限公司；DSQⅡ氣質聯用分析儀 美國Thermo Fisher Scientifi c公司。

1.3 方法

1.3.1 萃取工藝流程

萃取設備流程圖如圖1所示，萃取工藝流程：新鮮香根草根須→除雜→洗凈→烘干→粉碎→過篩→裝料→調整萃取過程變量→超臨界CO2萃取→減壓加熱分離→香根草油。

圖1 Spe-ed SFE Helix超臨界流體萃取系統流程圖Fig.1 Flow chart showing model Spe-ed SFE Helix supercritical fl uid extraction equipment

1.3.2 萃取釜最大裝料量的測定及裝料系數的計算

萃取釜最大裝料量的測定：對于一定粒徑的原料，采用自然重力堆積方式，即將原料自然流入圓柱形萃取釜內，不進行砸壓操作[9]，萃取釜的滿裝料量即為該粒徑原料的最大裝料量。

裝料系數計算見公式（1）[10]：

式中：m0為萃取釜的最大裝料量/g；m1為待萃物實際裝料量/g。

1.3.3 得率計算

式中：md為香根草粉末的裝料量/g；mp為萃取得到香根草油的質量/g。

1.3.4 單因素試驗

為全面考察萃取過程，需要合理進行超臨界CO2萃取的主要控制變量選擇[11]。本實驗選取香根草根須粉末粒徑、裝料系數、萃取溫度、萃取壓力、CO2流率以及萃取時間6 個變量。各個因素分別進行單因素試驗，每組平行進行3 次求平均值，以尋找每個因素的較優值。

1.3.5 響應面優化試驗

表1 響應面試驗因素與水平表Table1 Variables and levels used in Box-Benhnken design

根據單因素試驗的結論，利用數學分析軟件Design-Expert 8.05b的Box-Behnken試驗設計，選取萃取壓力、萃取溫度和CO2流率，考察各因素間的交互作用對得率的影響，以香根草油得率為響應值，設計三因素三水平的響應面試驗，因素水平見表1（其余因素均選取單因素試驗確定的優值，即粒徑60～80 目、裝料系數0.8、萃取時間1.5 h）。

1.3.6 驗證實驗

對響應面分析得到的預測最優條件進行實驗驗證，實驗平行進行3 次，計算該條件下香根草油的平均得率，并與預測值進行比較。

1.3.7 GC-MS聯用分析超臨界萃取香根草油

萃取所得香根草油用無水乙醇稀釋。

色譜條件：配備GsBP-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：起始溫度50 ℃，以15 ℃/min升至180 ℃，后以1 ℃/min至200 ℃，再以15 ℃/min 至260℃，保持3 min；高純氦氣做載氣，柱流速1.0 mL/min；進樣口溫度250 ℃，分流比20∶1，溶劑延遲時間3.2 min。

質譜條件：電子電離源70 eV；接口溫度250 ℃；離子源溫度250 ℃；質量掃描范圍m/z 40～650。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 粒徑對香根草油得率的影響

設定裝料系數0.8、萃取溫度45 ℃、萃取壓力10 MPa、CO2流率1 L/min、萃取時間2 h，粒徑采用20目以下、20～40、40～60、60～80目以及80目以上這5 個水平進行試驗，結果見圖2。

圖2 粒徑對香根草油得率的影響Fig.2 Effect of raw material granularity on the yield of vetiver essential oil

如圖2所示，隨著物料粒徑的變化香根草油得率變化非常顯著：隨著粒徑目數范圍的增加，得率呈現先升后降的趨勢，當粒徑在60～80 目范圍區間時，得率達到最大值。原料的顆粒粒徑的大小與超臨界CO2流體和待萃取物料的接觸面積大小直接相關，從而直接影響最終的得率。根據傳質原理，原料粒徑越小，利于CO2向物料內部遷移，從而增強了傳質效果[12]；且物料粒徑越小，其細胞的破損程度越高[13]，這兩方面的因素都有利于萃取。但粒度過小會增加表面流動阻力，甚至產生溝流現象，反而不利于萃取[14]。因此根據試驗結果，最適宜的粒徑范圍為60～80 目。

2.1.2 裝料系數對香根草油得率的影響

在對天然物質進行超臨界CO2萃取的過程中，必須考慮到物料會發生不同程度的溶脹現象，膨脹的程度與萃取溫度、萃取壓力和物料本身的性質等有關。為了防止由于溶脹導致的釜內局部壓強過高或憋壓等安全隱患的出現，必須在萃取釜內預留出一定的安全空間，確保操作安全。同時裝料量的多少也會影響物料的堆積密度和CO2的擴散阻力等，對得率有直接影響[15]。因此需要考察物料裝料系數的影響。首先測定萃取釜中全體積填料時的最大裝料量，對于粒徑為60～80 目的物料，容積為50 mL的萃取釜最大裝料量為5.67 g。

選取粒徑范圍粒徑60～80 目、萃取溫度45 ℃、萃取壓力10 MPa、CO2流率1 L/min、萃取時間2 h，裝料系數0.5、0.6、0.7、0.8、0.9這5 個水平進行試驗，結果見圖3。

圖3 裝料系數對香根草油得率的影響Fig.3 Effect of volume charge coeffi cient on the yield of vetiver essential oil

由圖3可以看出，裝料系數與得率之間存在一定的相關關系。裝料系數較小及較大的情況下得率均偏低，綜合考慮得率與設備生產安全、利用效率等因素，裝料系數選取0.8為宜。

2.1.3 萃取溫度對香根草油得率的影響

設定粒徑60～80 目、裝料系數0.8、萃取壓力10 MPa、CO2流率1 L/min、萃取時間2 h，萃取溫度選取35、40、45、50、55 ℃ 5 個水平進行試驗，結果見圖4。

圖4 萃取溫度對香根草油得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the yield of vetiver essential oil

超臨界CO2流體的溫度對萃取過程的影響是多方面的，這是因為超臨界流體以及待萃物的理化性質如CO2流體黏度和溶質溶解度等都和溫度直接有關[16]。由圖4可知，萃取溫度對香根草油的萃取得率影響顯著，在35～40 ℃范圍內得率較高且變化幅度較小，溫度達40 ℃以上萃取率急劇下降。這說明香根草油的超臨界萃取過程對溫度的變化敏感。因此萃取溫度取35 ℃左右為宜。

2.1.4 萃取壓力對香根草油得率的影響

設定粒徑60～80目、裝料系數0.8、萃取溫度35 ℃、CO2流率1 L/min、萃取時間2 h，萃取壓力選取10、15、20、25、30 MPa 5 個水平進行試驗，結果見圖5。

圖5 萃取壓力對香根草油得率的影響Fig.5 Effect of extraction pressure on the yield of vetiver essential oil

萃取壓力主要會影響超臨界流體的密度[17-18]，從而對得率產生影響。由圖5可知，在其他條件不變的情況下，隨著壓力的升高，超臨界流體密度增大，同時相對減少了傳質距離和傳質阻力，有利于萃取過程；當壓力超過一定數值后，超臨界壓力越高，CO2流體密度和黏度過大，傳質的效果反而變差，還會影響萃取的選擇性[19]，并且實際生產中高壓存在一定安全隱患。適宜的萃取壓力為20 MPa，這也與文獻[7,20]報道的結論一致。

2.1.5 CO2流率對香根草油得率的影響

本研究中超臨界萃取設備的流率監測點位于CO2排空口處，即為常溫常壓條件下的CO2體積流率。本實驗選取CO2流率分別為1.0 、1.5、2.0、2.5、3.0 L/min（即60～180 L/h范圍），進行單因素試驗，設定粒徑60～80 目、裝料系數0.8、萃取溫度35 ℃、萃取壓力20 MPa、萃取時間2 h進行萃取，結果見圖6。

圖6 CO 6 CO2流率對香根草油得率的影響Fig.6 Effect of CO2fl ow rate on the yield of vetiver essential oil

由圖6可知，當CO2流率在1.0～1.5 L/min范圍內時，香根草油得率隨著CO2流率的增加而增加，且流率為1.5 L/min時得率最大。CO2流率繼續增加，得率逐漸降低。CO2流率對萃取的影響是一個相對比較復雜的過程[21]。總體來說增大流率有利于萃取，但流率過大時可能造成CO2氣化排空與產物分離的過程中分離不徹底，反而降低了得率。因此根據試驗結果綜合考慮，CO2流率在1.5 L/min（90 L/h）左右為宜。

2.1.6 萃取時間對香根草油得率的影響

在粒徑60～80 目、裝料系數0.8、萃取溫度35 ℃、萃取壓力20 MPa條件下，CO2流率在單因素最優點附近選取1.0、1.5、2.0 L/min 3 種，考察萃取時間對得率的影響，結果見圖7。

圖7 萃取時間對香根草油得率的影響Fig.7 Effect of extraction time on the yield of vetiver essential oil

由圖7可知，在最佳CO2流率及其附近區間內，得率均隨著萃取時間的延長而單調遞增。當萃取時間大于1.5 h時，得率的增加明顯減緩，并且隨著時間的進一步延長，在2 h以后得率幾乎不再增加。1.5～2 h時間段內，得率增加量均小于0.3%，同時進一步增加了時間成本以及能耗，實際生產中意義不大。因此，綜合考慮，萃取時間在1.5 h為宜。

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 試驗結果與方差分析

綜合單因素試驗的結果，選取萃取壓力、萃取溫度、CO2流率這3 個對得率影響較大的因素，分析它們交互作用對得率的影響。采用三因素三水平的響應面分析方法，選用Box-Behnken模型進行試驗設計，響應面試驗方案與結果見表2。

表2中，第3、6、9、11、13號為中心（零點）試驗，其余12組為析因試驗。零點試驗共計重復進行5 次，用以計算試驗隨機誤差。根據試驗結果，利用Design-Expert 8.0.5b軟件對所得數據進行方差分析，結果見表3。3 個因素經過擬合得到Y（得率）的二次多元回歸方程為：Y=7.68＋0.16A＋0.059B＋0.16C＋0.11AB－0.005AC－0.23BC－0.100A2－0.31B2－0.20C2。

表2 響應面試驗設計及結果Table2 Box-Behnken design arrangement and corresponding experimental results for response surface analysis

表3 回歸方程方差分析表Table3 Analysis of variance of quadratic regression model

由表3可知，該二次多項式回歸模型的F值為10.95，P=0.002 3，達到了極顯著水平，證明該模型可以很好地描述各個變量與響應值之間的變化關系。相關系數R2=0.933 7，說明香根草油得率的試驗值與利用該方程得到的預測值之間非常接近，擬合程度較高。同時方程的失擬項遠未達到顯著水平，因此可用該回歸方程代替試驗真實點對結果進行分析和預測[22]。從分析中還可看出一次項A、C差異均達到極顯著水平。在所確定的試驗水平范圍內，各因素對響應值的影響程度順序為：A＞C＞B，即萃取壓力＞CO2流率＞萃取溫度。3 個因素中，萃取溫度和CO2流率之間有極顯著的交互作用。

2.2.2 各因素交互作用響應面分析

圖8 兩因素交互作用對香根草油收率的影響Fig.8 Response surface plot and contour plot showing the interactive effects of three factors on vetiver oil extraction yield

由圖8可知，萃取溫度與CO2流率的交互作用對香根草油得率的影響最為顯著，體現為三維響應面圖中曲面的彎曲程度較大、曲線較陡[23]，三維圖底部的等高線呈橢圓形；萃取壓力和萃取溫度的交互作用次強；而萃取壓力與CO2流率的交互作用最弱，表現為三維響應曲面較為平緩，底部等高線接近正圓形。利用擬合方程確定最佳工藝條件的方法如下：對回歸方程的各個因素均取一階偏導數為0，聯立即可求得香根草油得率達到最高時所需的參數條件，即A=0.870，B=0.136，C=0.305，換算成實際值即為萃取壓力22.61 MPa、萃取溫度35.41 ℃、CO2流率1.65 L/min，預測香根草油得率達到7.780%。

2.2.3 驗證實驗結果

為了驗證本方法所確定的擬合方程的可靠性及實際應用價值，采用上述最佳工藝條件進行實驗驗證，考慮到所用儀器設備所能達到的條件控制精度水平和操作方便，在驗證實驗中將香根草油的超臨界CO2萃取的最佳條件修正為萃取壓力22.6 MPa、萃取溫度35.4 ℃、CO2流率1.6 L/min（其余條件均取單因素試驗最優值）進行3 次驗證實驗，實際測得香根草油萃取的平均得率為7.762%，與理論預測值相比，絕對誤差小于0.019%。由此可見，采用響應面法優化得到的超臨界CO2萃取香根草油的參數準可靠，具有一定應用價值。

2.3 香根草油的GC-MS分析結果

在最優工藝參數條件下，對超臨界萃取出的香根草油進行了GC-MS分析。利用NIST數據庫進行比對并配合人工譜圖解析，對各個色譜峰進行了分析。香根草油成分復雜，分析難度較大，因其絕大部分成分為倍半萜類化合物及其氧化物[5]，故鑒定過程中著重分析該類化合物，且成分檢索過程中取值正向檢索匹配指數（search index，SI）及反向檢索匹配指數（reverse search index，RSI）均不小于700為可靠匹配結果，并利用面積歸一化法確定其百分含量，結果見表4（未列出SI值或RSI值小于700的色譜峰鑒定結果）。鑒定出的18 種成分總含量占總萃取物的69.88%，且多為各種食品添加劑、香料、中草藥的有效組分。

表4 超臨界CO 萃取香根草油的化學成分分析Table4 Chemical composition of vetiver essential oil

在鑒定出的各主要成分中，有一定藥用研究價值的化合物及其功效介紹如下：雅欖藍烯是獨活、山蒼子等傳統中藥材的主要成分，也常見于煙葉中，具有活血消腫、祛寒止痛的功能[24-25]；β-桉葉油醇是中藥蒼術的主要活性成分，具有燥濕健脾、祛風散寒、止瀉及明目等功效[26]；螺[環丙烷-1,8-橋亞甲基-3ah-環辛烯]庚酮和7-羥基-1,1,4,7-四甲基八氫化苯基環庚烯在中藥五味子的揮發油中均有檢出，且7-羥基-1,1,4,7-四甲基八氫化苯基環庚烯在五味子揮發油中的含量達35.06%，是該揮發油的主要成分，其藥理功效還有待于進一步研究[27-28]；α-愈創木烯在廣藿香、蒼術、人參、三七等藥材中均有檢出，有一定的抗菌抗腫瘤功效[29]。

可作為食品添加劑或香料、化妝品調香劑的化合物及其香氣特征介紹如下：異喇叭烯具有花香，存在于臘梅、茉莉等花朵精油中，是茉莉花的主要賦香成分，決定了其香氣濃度的基礎[30-31]；香根醇、香根酮是香根草特有的成分，由于突出的根香、壤香，故在配制東方型、海洋型、森林型、田園型香精中有特殊的作用[32]；柏木烯醇具木香和膏香，氣味溫和，留香持久，多用于化妝品、洗滌用品、膏霜類等日化香精，少量用于食用和煙用香精；脫氫香橙烯有木香、橘香等香氣[33]；月桂烯酮是一種香料中間體，可用來人工合成一些稀有名貴香料[34]。

3 結 論

在單因素試驗的基礎上，利用Design-Expert軟件，選擇Box-Behnken試驗設計法對超臨界CO2流體萃取香根草油工藝進行設計并優化。結果表明，萃取壓力、CO2流率對香根草油得率的影響極顯著，其中萃取溫度和CO2流率之間存在極顯著的交互作用。利用響應面分析方法所建立的數學模型對超臨界CO2萃取香根草油的工藝條件進行優化，可獲得最優的工藝參數，即為萃取壓力22.61 MPa、萃取溫度35.41 ℃、CO2流率1.65 L/min，預測香根草油得率達到7.780%。在此工藝條件下做驗證實驗，香根草油得率為7.762%，高于文獻[35]報道的水蒸餾法、溶劑萃取法得率。

利用GC-MS對超臨界方法得到的香根草油進行了成分分析，基本確定了其主要成分，主要包含柏木烯醇、脫氫香橙烯、月桂烯酮以及香根草特有的香根醇、香根酮等化合物，并按照應用領域對香根草油的主成分進行了分類，為香根草油進一步開發利用提供了相關依據。

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Supercritical CO2Extraction and Chemical Composition Analysis of Vetiver Essential Oil

LIAO Yaohua1, WANG Dan1, WANG Baoqing1, LIU Zhenfeng1, REN Baozeng1,*, WANG Hongli2
(1. School of Chemical Engineering and Energy, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China; 2. Henan Chemical Industry Research Institute Co. Ltd., Zhengzhou 450052, China)

This work was conceived to optimize the extraction of essential oil from fresh vetiver roots by supercritical carbon dioxide fl uid extraction (SCFE-CO2). Firstly, one-factor-at-a-time (OFAT) method was employed to examine the effects of particle size of powdered vetiver roots, volume charge coeffi cient, extraction pressure, extraction temperature, CO2fl ow rate and extraction time on the yield of vetiver oil. Subsequently, three key factors including extraction temperature, extraction pressure and CO2fl ow rate were optimized by response surface methodology (RSM) based on Box-Behnken design using oil yield as the response variable. The results indicated that the optimum conditions that provided the highest extraction yield were determined as follows: raw material granularity, 60-80 mesh; volume charge coeffi cient, 0.8; extraction pressure, 22.61 MPa; extraction temperature, 35.41 ℃; CO2fl ow rate, 1.65 L/min; and extraction time, 1.5 h. Under these conditions, the predicted maximum yield of vetiver oil was 7.780%, agreeing with the experimental value (7.762%). The chemical composition of the extracted essential oil was analyzed by GC-MS. A total of 18 compounds which accounted for 69.88% of the total extract were identifi ed including 8-cedren-13-ol, dehydro-aromadendrene, myrcenone, vetiverol and vetiverone as the main components. The applications of these components in various fi elds were summarized in this work.

supercritical CO2extraction; vetiver essential oil; response surface methodology;gas chromatography-mass spectroscopy (GC-MS)

TS201

A

1002-6630（2015）20-0079-07

10.7506/spkx1002-6630-201520014

2015-02-11

廖耀華（1990—），男，碩士研究生，研究方向為綠色化工與技術。E-mail：155002573@qq.com

*通信作者：任保增（1962—），男，教授，博士，研究方向為綠色化工與技術。E-mail：renbz@zzu.edu.cn