高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定發(fā)酵前后果蔬中4 種水溶性維生素

聶啟興，馮 蕾，張媛媛，聶少平,*，熊 濤，謝明勇

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.石家莊學(xué)院化工學(xué)院，河北 石家莊 050035）

高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定發(fā)酵前后果蔬中4 種水溶性維生素

聶啟興1，馮 蕾1，張媛媛2，聶少平1,*，熊 濤1，謝明勇1

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.石家莊學(xué)院化工學(xué)院，河北 石家莊 050035）

建立高效液相色譜-串聯(lián)紫外-熒光檢測(cè)器同時(shí)測(cè)定發(fā)酵前后果蔬中4 種水溶性B族維生素（硫胺素（VB1）、核黃素（VB2）、煙酸（VB3）和吡哆醇（VB6））的分析新方法。在已優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，4 種待測(cè)物的分離效果較好，儀器檢出限在0.23～54 μg/L之間，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)在0.998 2～0.999 9之間，線(xiàn)性關(guān)系良好。枸杞果漿在3 個(gè)添加水平的平均回收率在86.99%～110.23%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.25%～6.88%之間。該方法簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確、選擇性好，可用于發(fā)酵前后果漿中4 種水溶性維生素的同時(shí)測(cè)定。

水溶性維生素；發(fā)酵；高效液相色譜

水溶性維生素是維持人體生命健康必不可少的一類(lèi)有機(jī)化合物，主要包括B族維生素與VC[1]。水溶性維生素缺乏可導(dǎo)致癲癇[2]、口角炎[3]、心功能障礙[4]、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等多種疾病。發(fā)酵是指通過(guò)微生物的生長(zhǎng)繁殖和代謝活動(dòng)，產(chǎn)生和積累人們所需產(chǎn)品的生物反應(yīng)過(guò)程[5]。發(fā)酵食品具有調(diào)節(jié)腸道菌群，提高免疫力和抗癌等作用[6-10]。然而，發(fā)酵過(guò)程會(huì)導(dǎo)致食品中維生素含量發(fā)生變化[11-13]，因此，研究建立發(fā)酵前后果漿中水溶性維生素分析方法，對(duì)于監(jiān)測(cè)果蔬發(fā)酵過(guò)程中水溶性維生素的含量變化，進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵果蔬生產(chǎn)工藝有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。

由于水溶性維生素的結(jié)構(gòu)差異較大，且發(fā)酵前后果蔬樣品基質(zhì)復(fù)雜，因此，較難實(shí)現(xiàn)樣品中水溶性維生素的同時(shí)測(cè)定。目前，對(duì)于水溶性維生素的分析測(cè)定主要采用高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）法[14-17]。其中，質(zhì)譜分析法[15]的設(shè)備昂貴難于普及，從而限制了其在水溶性維生素研究中的應(yīng)用；紫外分析法[14,18]的靈敏度較低，僅適用于樣品中豐度較高的維生素的分析測(cè)定；熒光分析法[19]具有較高的靈敏度和選擇性，但無(wú)法用于自體熒光響應(yīng)較差的維生素的分析。因此，單獨(dú)的紫外檢測(cè)法或熒光檢測(cè)法無(wú)法滿(mǎn)足發(fā)酵前后果蔬樣品中水溶性維生素的同時(shí)測(cè)定。基于此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用HPLC-串聯(lián)紫外-熒光檢測(cè)（HPLC-ultraviolet-fluorescence detector，HPLC-UV-FLD）法，建立同時(shí)分析發(fā)酵前后果蔬中4 種水溶性B族維生素（硫胺素（VB1）、核黃素（VB2）、煙酸（VB3）和吡哆醇（VB6））的新方法，取得了較為滿(mǎn)意的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮枸杞漿、胡蘿卜漿、雪梨汁、柚子汁，發(fā)酵枸杞漿、胡蘿卜漿、雪梨汁、柚子汁均由本實(shí)驗(yàn)室自制。

標(biāo)準(zhǔn)品（VB1、VB2、VB3、VB6，純度均大于98.5%） Aladdin-阿拉丁試劑（上海）有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為屈臣氏蒸餾水 廣州屈臣氏食品飲料有限公司；甲酸、乙腈均為色譜純。

1260 HPLC儀（配備G1311C四元泵、G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316C柱溫箱、G4121A DAD二極管陣列檢測(cè)器、G1321A FLD、ChemStation B.04.02色譜工作站）美國(guó)Agilent科技有限公司；高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Thermo Electron LED GmbH公司；超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；XS-105電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取上述4 種維生素標(biāo)準(zhǔn)品，用體積分?jǐn)?shù)1%甲酸溶液配制成質(zhì)量濃度為200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4 ℃保存。使用時(shí)用體積分?jǐn)?shù)0.08%甲酸溶液逐級(jí)稀釋?zhuān)渲苹旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作液，以上操作均在避光條件下進(jìn)行。

1.2.2 樣品處理

（1）通過(guò)對(duì)綏中縣水資源評(píng)價(jià)，可知該地區(qū)水資源開(kāi)采量小于補(bǔ)給量，但水質(zhì)污染問(wèn)題突出，因此用水矛盾也會(huì)逐步顯現(xiàn)。

枸杞漿、胡蘿卜漿：稱(chēng)取樣品2.5 g（精確至0.000 1 g）于50 mL離心管中（錫箔紙包裹避光），加入10 mL體積分?jǐn)?shù)0.08%甲酸溶液超聲水浴中室溫條件下提取10 min，然后置于高速冷凍離心機(jī)中10 000 r/min離心10 min，離心溫度16 ℃，移取上清液。重復(fù)提取1 次，合并上清液，定容至25 mL容量瓶，樣品經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣分析。

柚子汁、雪梨汁：稱(chēng)取樣品10 g（精確至0.000 1 g），加入10 mL體積分?jǐn)?shù)0.08%甲酸溶液超聲水浴中室溫提取10 min，離心后定容于25 mL容量瓶，樣品經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣分析。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流量0.5 mL/min。實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫，流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.08%甲酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈，洗脫程序如表1所示。紫外檢測(cè)VB1、VB3含量，檢測(cè)波長(zhǎng)為275 nm；熒光檢測(cè)VB2、VB6含量，激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)分別為VB2（374 nm/524 nm）、VB6（293 nm/396 nm）。

表1 梯度洗脫程序Table1 Gradient elution program

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

由于VB1、VB3和VB6的極性較強(qiáng)，在C18柱上的保留能力比較弱，而VB2的極性相對(duì)較弱，在C18柱上的保留能力比較強(qiáng)。因此，實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫[20-21]。

圖1 4 種水溶性維生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standards of four water-soluble vitamins

2.2 線(xiàn)性關(guān)系與檢出限

取少量維生素標(biāo)準(zhǔn)溶液混合配制成維生素標(biāo)準(zhǔn)混合液，VB1、VB3、VB6、VB2的質(zhì)量濃度依次為50、50、2.5、10 mg/L，用體積分?jǐn)?shù)0.08%甲酸溶液逐級(jí)稀釋成一系列不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液（n=8）。按1.2.3節(jié)色譜條件進(jìn)行HPLC分析（紫外法檢測(cè)VB1、VB3，熒光法檢測(cè)VB2、VB6），以吸收峰面積（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線(xiàn)性擬合，以3 倍信噪比為儀器檢出限，同時(shí)分別稱(chēng)取2.5 g新鮮胡蘿卜和10 g黃冠梨，按1.2.2節(jié)方法提取得到水溶性維生素提取液，提取液再經(jīng)過(guò)稀釋后上機(jī)測(cè)定，以3 倍信噪比得出4 種水溶性維生素的方法檢出限。由表2可知，4 種組分在線(xiàn)性范圍內(nèi)，峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系（r2均大于0.998），儀器檢出限在0.23～54 μg/L之間，以胡蘿卜為基質(zhì)的方法檢出限在2.30～345 μg/kg之間，以黃冠梨為基質(zhì)的方法檢出限在14.5～135 μg/kg之間。

表2 4 種水溶性維生素的線(xiàn)性范圍、線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table2 Linear equations with correlation coeffi cients, limits of detection (LODs) and limits of quantifi cation (LOQs) for four water soluble vitamins

2.3 方法精密度與回收率

表3 添加回收率及RSD結(jié)果Table3 Result of spiked recoveries and relative standard deviations

取未發(fā)酵枸杞果漿為原料，分別添加3 個(gè)不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率和精密度實(shí)驗(yàn)。未加標(biāo)枸杞果漿和加標(biāo)枸杞果漿按1.2.2節(jié)方法進(jìn)行樣品處理后，按1.2.3節(jié)色譜條件進(jìn)行分析，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定6 次，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3，枸杞果漿樣品及樣品加標(biāo)色譜如圖2所示。結(jié)果顯示，4 種待測(cè)物的加標(biāo)回收率在86.99%～110.23%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在1.25%～6.88%之間。以上結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確可靠，可用于實(shí)際樣品的測(cè)定。

圖2 枸杞及枸杞加標(biāo)色譜圖Fig.2 Chromatograms of unspiked and spiked wolfberries with UV detector (A) and fl uorescence detector (B)

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果

表4 發(fā)酵前后樣品測(cè)定結(jié)果（n=3）Table4 Water soluble vitamin contents of fermented and unfermented wolfberries (n= 3) mg/kg

取發(fā)酵前后枸杞漿、胡蘿卜漿、柚子汁、黃冠梨汁以及滅菌胡蘿卜漿、黃冠梨汁進(jìn)行4 種水溶性維生素測(cè)定。以保留時(shí)間定性，色譜峰面積定量，外標(biāo)法測(cè)定維生素含量，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次（n=3），結(jié)果見(jiàn)表4。對(duì)于VB1，枸杞、黃冠梨和胡蘿卜中發(fā)酵后含量提高，其中黃冠梨發(fā)酵前未檢出，發(fā)酵后檢出，而柚子中發(fā)酵后含量減少；VB2及VB3經(jīng)發(fā)酵后含量均減少；VB6除黃冠梨含量有輕微上升，其余均減少。由黃冠梨和胡蘿卜中發(fā)酵前樣品以及發(fā)酵前滅菌樣品的對(duì)比可知，滅菌會(huì)減少黃冠梨VB2含量而不影響胡蘿卜VB2含量，對(duì)其余3 種維生素則有略微增加。Beitane等[22]報(bào)道通過(guò)增加牛奶中不同濃度的乳果糖和菊粉后由雙歧桿菌發(fā)酵均可提高VB1的含量，但對(duì)于VB6，則與添加濃度有很大的關(guān)系；Champagne等[23]報(bào)道通過(guò)瑞士乳桿菌單獨(dú)發(fā)酵或者與嗜熱鏈球菌和雙歧桿菌混合發(fā)酵大豆飲品會(huì)提高VB1的含量，但結(jié)果不顯著，同時(shí)，對(duì)VB6含量沒(méi)有影響；Hou等[11]報(bào)道雙歧桿菌發(fā)酵豆?jié){后減少了VB3的含量。所以對(duì)于樣品柚子汁中VB1含量的減少可能是因?yàn)殍肿又刑穷?lèi)含量較少，缺乏益生菌發(fā)酵的底物，從而導(dǎo)致含量的降低，而其他維生素含量的變化可能是發(fā)酵過(guò)程中一些其他變量變化導(dǎo)致的結(jié)果。也有其他的一些報(bào)道[24-25]得出一些食品發(fā)酵前后維生素含量的變化，但結(jié)果各異。本實(shí)驗(yàn)所用發(fā)酵菌種為干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌以及植物乳桿菌混合而成的混合發(fā)酵劑，因此發(fā)酵前后維生素含量可能因?yàn)樵稀⒕N、發(fā)酵條件等的差異而呈現(xiàn)不同的結(jié)果。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立一種HPLC-UV-FLD法同時(shí)檢測(cè)發(fā)酵前后果蔬中4 種水溶性維生素的方法，采用甲酸溶液與乙腈溶液為流動(dòng)相，方便快捷、回收率穩(wěn)定、線(xiàn)性良好，為發(fā)酵食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)以及優(yōu)化發(fā)酵工藝條件提供一定參考依據(jù)，而發(fā)酵過(guò)程中引起維生素含量變化的原因，則需要進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討。

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Simultaneous Determination of Four Water-Soluble Vitamins in Fresh and Fermented Vegetables and Fruits by High-Performance Liquid Chromatography

NIE Qixing1, FENG Lei1, ZHANG Yuanyuan2, NIE Shaoping1,*, XIONG Tao1, XIE Mingyong1
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2. School of Chemical Engineering, Shijiazhuang University, Shijiazhuang 050035, China)

A simple, sensitive and selective method was developed for simultaneous determination of four water-soluble B vitamins including thiamine (VB1), ribofl avin (VB2), nicotinic acid (VB3) and pyridoxal (VB6), in fresh and fermented vegetables and fruits by high-performance liquid chromatography (HPLC) coupled with UV and fluorescence detector. Under the optimized conditions, all four compounds were well separated. The instrumental limits of detection and limits of quantifi cation for the four B vitamins ranged from 0.23 to 54 μg/L, respectively, and good linear correlation was observed with R2of 0.998 2 to 0.999 9. Recoveries of the four B vitamins in goji berries (Lycium barbarum) were in the range of 86.99%-110.23% at three spiked levels, with relative standard deviations (RSDS) of 1.25%-6.88%. This method is simple, rapid, accurate and selective, and can be successfully applied to the simultaneous determination of four water-soluble vitamins in fresh and fermented fruits and vegetables.

water-soluble vitamins; fermentation; high-performance liquid chromatography

Q563

A

1002-6630（2015）20-0101-04

10.7506/spkx1002-6630-201520018

2015-03-17

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2011AA100904）

聶啟興（1993—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)。E-mail：18770045074@163.com

*通信作者：聶少平（1978—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與分析、食品營(yíng)養(yǎng)與安全、食品復(fù)雜碳水化合物。

E-mail：spnie@ncu.edu.cn