基于GC-MS和GC-O聯用法分析佛手精油關鍵香氣成分

楊 君，郜海燕，儲國海，李澤樺，牛云蔚，蔡 銘，胡安福，蔣 健,*

（1.浙江中煙工業有限責任公司，浙江 杭州 310009；2.浙江省農業科學院食品科學研究所，浙江 杭州 310021；3.浙江工業大學海洋學院，浙江 杭州 310014；4.上海應用技術學院香料香精技術與工程學院，上海 201418）

基于GC-MS和GC-O聯用法分析佛手精油關鍵香氣成分

楊 君1，郜海燕2，儲國海1，李澤樺3，牛云蔚4，蔡 銘3，胡安福1，蔣 健1,*

（1.浙江中煙工業有限責任公司，浙江 杭州 310009；2.浙江省農業科學院食品科學研究所，浙江 杭州 310021；3.浙江工業大學海洋學院，浙江 杭州 310014；4.上海應用技術學院香料香精技術與工程學院，上海 201418）

研究佛手精油的揮發性物質和關鍵香氣成分。佛手經水蒸氣蒸餾法提取精油，利用氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）結合氣相色譜-嗅聞（gas chromatography-olfactometry，GC-O）技術對揮發性物質和香氣成分進行分析。GC-MS-O檢測出36 種揮發性物質，主要成分為D-檸檬烯（34.69%）、γ-松油烯（20.42%）、β-甜沒藥烯（4.59%）。采用稀釋法和強度法分析發現D-α-蒎烯、D-檸檬烯、β-芳樟醇、別羅勒烯、4-松油醇、α-佛手柑烯具有較大的香氣強度；D-α-蒎烯、β-蒎烯、β-羅勒烯、橙花乙酸酯、α-佛手柑烯具有較大風味稀釋因子。綜合分析認為D-α-蒎烯和α-佛手柑烯是佛手精油的關鍵特征香味成分。

佛手精油；香氣成分；氣相色譜-質譜聯用儀；氣相色譜-嗅聞技術

佛手（Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle）是蕓香科柑橘屬植物香櫞的變種，為常綠小喬木，由于果實頂部張開呈指狀，因此得名[1]。佛手精油含量較高，主要存在于佛手果實的外果皮、中果皮中，色澤透明或淡黃色，具有清新怡人的特征香味，常作為高檔香料而廣泛應用于食品、化妝品領域[2]。佛手精油具有較多生理活性功能，如治療胃痛、脅漲、嘔吐、痰飲咳嗽、解酒等[3]。佛手精油主要物質是檸檬烯，此外還含有一定量γ-松油烯、β-蒎烯、β-月桂烯等物質[4-5]。研究[6-8]表明，檸檬烯對大腸桿菌O157∶H7和腸炎沙門氏菌具有很強抑制作用，γ-松油烯對沙門氏菌具有較好抑菌活性。Peng等[4]發現佛手精油能促進胰島素分泌，可用于治療Ⅱ型糖尿病。Somrudee等[9]報道佛手精油具有抗焦慮效果。實驗證明，佛手揮發油對支氣管哮喘動物具有止咳、平喘、祛痰等治療作用[10]。此外，佛手精油還可改善情緒、應激障礙等輕度癥狀[11]。目前，對佛手精油揮發性成分的研究已取得了眾多進展，但對其關鍵香氣成分的研究還尚屬空白。

氣相色譜-嗅聞（gas chromatography-olfactometry，GC-O）法是目前香氣成分分析的重要手段之一。GC-O是一種直觀的感官檢測方法，即通過人的鼻子直接嗅聞復雜的混合氣味從而篩選出具有氣味的化合物，并對氣味特征進行評價。GC-O可以發現食品中大量揮發性成分中真正具有氣味活性的成分和各氣味成分在不同濃度條件下對整體氣味的貢獻，在鑒別特征香味化合物、香味活性化合物等方面具有明顯的優勢，廣泛應用于食品、環境監測等領域[12-16]。常用的GC-O檢測方法有稀釋法、強度法、檢測頻率法等[17]。稀釋法是將被分析物稀釋一定倍數，嗅辨師鑒定在哪個稀釋度條件下仍然能聞到，并描述該氣味。風味稀釋因子（flavor dilution factor，FD）是氣味化合物能被感知的最大稀釋度，FD值高的物質即被認為是重要的致香物質。強度法是根據實際嗅聞到的氣味強度評價各化合物對整體香氣貢獻程度，化合物氣味強度越大，其對香氣整體貢獻就越大。

本實驗采用氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）技術鑒定佛手精油中揮發性物質，利用GC-O稀釋法和強度法評價各香氣成分對整體香味的貢獻，對佛手精油在食品藥品、香精香料領域中的應用具有一定的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金華佛手柑（2014年） 浙江金手寶生物科技有限公司；無水乙醇為色譜純，乙醚、無水硫酸鈉均為分析純。

1.2 儀器與設備

TRACE1300GC儀配有ISQ LT MS儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；Sniffer 9000嗅味檢測儀 瑞士Brechbühler公司。

1.3 方法

1.3.1 佛手精油的分離提取

取金華佛手柑果實切成1 cm×1 cm×1 mm片狀。按料液比1∶10（g/mL）加入蒸餾水，加熱至微沸，自沸騰起計時保持3 h，收集精油，加入一定量的Na2SO4至精油中，靜置過夜，過濾，用乙醚洗滌Na2SO4，并將洗滌液與濾液合并，用0.45 μm有機膜過濾精油，揮發除盡乙醚，得佛手脫水精油。

1.3.2 GC-MS分析條件

GC條件：DB-5 MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；分流比10∶1；進樣量1.0 μL；進樣溫度250 ℃；載氣為高純氦氣，純度大于99.999%；流量1.0 mL/min；程序升溫：50 ℃保持1 min，5 ℃/min升到130 ℃，保持0.5 min，15 ℃/min升到250 ℃，保持10 min。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度280 ℃；質量掃描范圍50～500 u；用Mainlab譜庫檢索加以確認。各物質相對含量采用峰面積歸一化法確定。

1.3.3 GC-O分析條件

GC-O系統由GC（配氫火焰離子檢測器（flame ionization detector，FID））和Sniffer嗅辨儀組成。

GC條件：DB-5 MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；分流比10∶1；進樣量1.0 μL；進樣溫度250 ℃；FID檢測器溫度為280 ℃；載氣為高純氦氣，純度大于99.999%，流量1.0 mL/min。程序升溫條件同GC-MS。氣相毛細管柱末端以分流比為1∶1分別連接FID檢測器和Sniffer嗅辨儀。GC柱箱與嗅辨儀傳輸線溫度220 ℃，在嗅覺端口處對氣體進行加濕，防止因氣體干燥引起嗅辨師不適。

嗅辨師經專業訓練，熟悉各種香味并掌握一定量術語描述香味與香氣特征。為避免嗅覺疲勞，每次嗅聞時間不超過40 min，且2 次嗅聞之間至少間隔30 min。實驗采用稀釋法和強度法，即嗅辨師在實驗過程中需描述聞到的氣味和強度。樣品逐級稀釋（分別稀釋50、100、200、400 倍等），直到嗅辨師聞不到氣味為止。每種香味化合物最高稀釋倍數即為FD值，氣味強度級別表示見表1。

表1 5 級氣味強度表示法[18]Table1 Descriptions of odor intensities[18]

2 結果與分析

樣品經GC-MS分析，結果如表2所示，總離子流圖如圖1所示。共發現33 種物質，其中烯烴類物質16 種，相對峰面積占83.53%；醇類物質6 種，相對峰面積占7.40%；酸類物質3 種，相對峰面積占7.48%；酯類物質3 種，相對峰面積占0.85%；酚類物質2 種，相對峰面積占0.23%；醛類物質2 種，相對峰面積占0.18%和烷烴物質1 種，相對峰面積占0.31%。相對含量超過1%的物質有D-檸檬烯（34.69%）、γ-松油烯（20.42%）、β-甜沒藥烯（4.59%）、月桂酸（2.98%）、α-松油醇（2.63%）、石竹烯（2.53%）、肉豆蔻酸（1.98%）、4-萜品醇（1.91%）、2-蒈烯（1.73%）、棕櫚酸（1.53%）、β-蒎烯（1.48%）、β-羅勒烯（1.26%）、大牻牛兒烯（1.23%）、D-α-蒎烯（1.20%）。結果與其他學者研究基本相符。陳麗君等[19]從橙油中檢測到35 種揮發性物質，其中相對含量較高的化合物為檸檬烯（80.79%）、芳樟醇（3.85%）、癸醛（2.90%）、β-月桂烯（1.94%）、β-蒎烯（0.82%）等。金宏等[20]報道佛手揮發油中95%以上物質是檸檬烯、1-甲基-（1-甲乙基）-苯、β-蒎烯和α-蒎烯。趙磊等[21]定性定量分析了12 種金華佛手的揮發油，鑒定出27 種化學成分，主要成分均是檸檬烯和γ-松油烯。檸檬烯通常是柑橘類精油中含量最高的物質，相對含量可達60%～90%，相對含量與種植環境、成熟程度有關[22-25]。檸檬烯可作為用于掩蓋某些生物堿苦味的風味改良劑或作為合成香芹酮的前體物質。通過GC-O分析，共發現26 種物質，其中有3 種風味物質（保留時間在3.35、3.90、27.70 min）并未在MS分析中檢測出，可能是相對含量低于MS的檢測限而沒有被檢測到。

表2 佛手精油GC-MS和GC-O分析結果Table2 Analytical results of fi nger citron essential oil by GC-MS-O

續表2

圖1 佛手精油GC-MS總離子流圖Fig.1 GC-MS TIC chromatogram for fi nger citruon essential oil

圖2 佛手精油的強度法（A）和稀釋法（B）圖譜Fig.2 GC-MS-O analysis of fi nger citron essential oil

由圖2A可知，香氣強度值最大的物質為D-α-蒎烯（強度值為4），其他較大的物質有D-檸檬烯（強度值為3）、β-芳樟醇（強度值為3）、別羅勒烯（強度值為3）、4-萜品醇（強度值為3）、α-佛手柑烯（強度值為3），說明它們是佛手精油香味的重要成分。由圖2B可知，在稀釋法中，D-α-蒎烯、β-蒎烯、β-羅勒烯、橙花乙酸酯、α-佛手柑烯FD值都達到400，說明它們在濃度極低的情況下仍可提供強烈的香氣，被認為對佛手精油香味的影響非常大。物質氣味強度和濃度之間存在一定關系，Kamadia等[26]采用稀釋法證實了物質氣味強度和濃度之間滿足Steven’s Law定律。因此，稀釋法可以彌補強度法的缺陷，二者優勢互補，更有利于把握佛手精油中的關鍵致香物質。佛手精油整體嗅香主要表現為清香、甜香、果香為主體的香韻，經過嗅辯師反復聞香鑒定，強度和稀釋度均為最大的D-α-蒎烯表現出強烈的清甜果香，與精油的頭香果香味很相似，確定為佛手精油的主體香韻，α-佛手柑烯表現為清甜香、柑橘香，也與佛手的香韻非常相似。而其他物質的香氣強度或濃度未達到主體香的要求，故確定D-α-蒎烯和α-佛手柑烯是佛手精油的特征香味，即佛手精油的關鍵致香物質。以上分析也說明，各化合物是否是關鍵致香物質，不能僅靠單一的方法來進行判斷，稀釋法和強度法結合可以更有效的鑒別精油的關鍵致香物質。

對比GC-MS和GC-O分析，D-檸檬烯和γ-松油烯相對含量雖然較高，但FD值較小，說明其對佛手精油的整體香氣影響較小，從結果可以看出，對佛手精油香味貢獻大的物質相對含量并不一定大，僅從相對含量來比較不同成分對香味的貢獻是不準確的，需要結合閾值才能得出更真實的結果。

3 結 論

利用GC-MS和GC-O鑒定出佛手精油中揮發性成分和香氣物質36 種。佛手精油主要成分是D-檸檬烯（34.69%）、γ-松油烯（20.42%）、β-甜沒藥烯（4.59%）等。佛手精油中烯烴相對含量占到大部分，達83.53%，酸類、醇類、酯類、酚類、醛類和烷烴分別占到總相對含量的7.48%、7.40%、0.85%、0.23%、0.18%和0.31%。嗅聞實驗中采用強度法和稀釋法結合的方法，發現D-α-蒎烯、D-檸檬烯、β-芳樟醇、4-松油醇、α-佛手柑烯具有較大的強度，D-α-蒎烯、β-蒎烯、β-羅勒烯、橙花乙酸酯、α-佛手柑烯具有較大FD值。綜合分析后確定D-α-蒎烯和α-佛手柑烯是佛手精油的特征香味。

近年來，食品風味方面的研究越來越受到人們的重視，GC-O作為分析風味物質的有力工具，應用越來越多，尤其是食品和飲料領域。本實驗利用GC-MS-O聯用方法，快速準確地篩選出香氣中關鍵致香物質，為佛手精油在食品藥品、添香領域的應用提供理論參考，并為香精香料進一步研究開發提供新的思路。

[1] 張興旺. 佛手的用途和栽培管理[J]. 中國南方果樹, 2003, 32(2): 7-8.

[2] 何云芳, 金曉玲. 佛手的研究現狀及發展前景[J]. 經濟林研究, 2001, 19(4): 41-43.

[3] 王建英, 施長春, 朱婉萍. 金佛手揮發油化學成分的GC-MS研究[J].中國現代應用藥學雜志, 2006, 23(1): 32-34.

[4] PENG C H, KER Y B, WENG C F, et al. Insulin secretagogue bioactivity of fi nger citron fruit (Citrus medica L. var. sarcodactylis Hort, Rutaceae)[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(19): 8812-8819.

[5] FARHAT A, FABIANO A. Microwave steam diffusion for extraction of essential oil from orange peel: kinetic data, extract’s global yield and mechanism[J]. Food Chemistry, 2011, 125(1): 255-261.

[6] ESPINA L, SOMOLINOS M, LORAN S, et al. Chemical composition of commercial citrus fruit essential oils and evaluation of their antimicrobial activity acting alone or in combined processes[J]. Food Control, 2011, 22(6): 896-902.

[7] 張萍, 王平, 石超峰, 等. 油樟油主成分對幾種常見病原菌的抑菌活性研究[J]. 四川農業大學學報, 2013, 31(4): 393-397.

[8] 郭衛東, 鄭建樹, 鄧剛, 等. 佛手揮發油抑菌活性的研究[J]. 中國糧油學報, 2009, 24(8): 103-107.

[9] SOMRUDEE S, CHARLES A M. Acute effects of bergamot oil on anxiety-related behaviour and corticosterone level in rats[J]. Phytother Research, 2011, 25(6): 858-862.

[10] 楊慧, 周愛梅, 林敏浩, 等. 佛手揮發精油提取及其藥理研究進展[J].食品安全質量檢測學報, 2013, 4(5): 1347-1352.

[11] BAGETTA G, MORRONE L A, ROMBOLA L, et al. Neuropharmacology of the essential oil of bergamot[J]. Fitoterapia, 2010, 81(6): 453-461.

[12] BUENO M, RESCONI V C, CAMPO M, et al. Gas chromatographicolfactometric characterisation of headspace and mouthspace key aroma compounds in fresh and frozen lamb meat[J]. Food Chemistry, 2011, 129(4): 1909-1918.

[13] ZHANG S, CAI L, KOZIEL J A, et al. Field air sampling and simultaneous chemical and sensory analysis of livestock odorants with sorbent tubes and GC-MS/olfactometry[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2010, 146(2): 427-432.

[14] 張玉玉, 孫寶國, 祝鈞. 牛至精油揮發性成分的GC-MS與GC-O分析[J].食品科學, 2009, 30(16): 275-277.

[15] 喬宇, 范剛, 程薇, 等. 固相微萃取結合GC-O分析兩種葡萄柚汁香氣成分[J]. 食品科學, 2012, 33(2): 194-198.

[16] 楊崢, 公敬欣, 張玲, 等. 漢源紅花椒和金陽青花椒香氣活性成分研究[J]. 中國食品學報, 2014, 14(5): 226-230.

[17] RUTH S M V. Methods for gas chromatography-olfactometry: a review[J]. Biomolecular Engineering, 2001, 17(4): 121-128.

[18] 陳麗君. 采用GC-MS/O分析精油和煙草中致香物質[D]. 上海: 復旦大學, 2011.

[19] 陳麗君, 高建宏, 王申, 等. 氣相色譜-質譜與嗅覺測量法聯用分析橙油中致香物質[J]. 精細化工, 2012, 29(2): 142-208.

[20] 金宏, 公衍玲, 趙文英. 佛手揮發油GC-MS指紋圖譜研究[J]. 化學與生物工程, 2009, 26(4): 76-78.

[21] 趙磊, 籍保平, 周峰, 等. 十二種金華佛手揮發油成分的比較研究[J].食品科學, 2006, 27(6): 179-184.

[22] KIM K N, KO Y J, YANG H M, et al. Anti-inflammatory effect of essential oil and its constituents from fi ngered citron (Citrus medica L. var. sarcodactylis) through blocking JNK, ERK and NF-kappaB signaling pathways in LPS-activated RAW 264.7 cells[J]. Food and Chemical Toxicology, 2013, 57: 126-131.

[23] 牛麗影, 郁萌, 劉夫國, 等. 香櫞精油的組成及香氣活性成分的GCMS-O分析[J]. 食品與發酵工業, 2013, 39(4): 186-191.

[24] GONZALEZ-MOLINA E, DOMINGUEZ-PERLES R, MORENO D A, et al. Natural bioactive compounds of citrus limon for food and health[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2010, 51(2): 327-345.

[25] MICHEL T, COKOJA M, SIEBER V, et al. Selective epoxidation of (+)-limonene employing methyltrioxorhenium as catalyst[J]. Journal of Molecular Catalysis A: Chemical, 2012, 358: 159-165.

[26] KAMADIA V V, YOON Y, SCHILLING M W, et al. Relationships between odorant concentration and aroma intensity[J]. Journal of Food Science, 2006, 71(3): 193-197.

Characterization of Volatile Constitutes and Odorous Compounds in Essential Oil of Finger Citron(Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle) by GC-MS and GC-O

YANG Jun1, GAO Haiyan2, CHU Guohai1, LI Zehua3, NIU Yunwei4, CAI Ming3, HU Anfu1, JIANG Jian1,*
(1. China Tobacco Zhejiang Industrial Co. Ltd., Hangzhou 310009, China; 2. Institute of Food Science, Zhejiang Acadmy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China; 3. College of Ocean, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China; 4. Shanghai Institute of Technology, School of Perfume and Aroma Technology, Shanghai 201418, China)

The volatile constitutes and odorous compounds in essential oil of finger citron (Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle) were evaluated. The oil was extracted by hydrodistillation and analyzed by gas chromatographymass spectrometry (GC-MS) and gas chromatography-olfactometry (GC-O). A total of 36 compounds in the oil were identifi ed, among which, D-limonene (34.69%), γ-terpinene (20.42%), and β-bisabolene (4.59%) were the main compounds. D-α-pinene, D-limonene, β-linalool, allo-ocimene, terpin-4-ol and α-bergamotene displayed strong aromatic intensity, while D-α-pinene, β-pinene, β-ocimene, neryl acetate and α-bergamotene showed relatively higher fl avor dilution (FD) factor. The results demonstrated that D-α-pinene and α-bergamotene were the key contributors to the characteristic aroma of fi nger citron oil.

finger citron essential oil; odorous compounds; gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS); gas chromatography-olfactometry (GC-O)

TS255.1

A

1002-6630（2015）20-0194-04

10.7506/spkx1002-6630-201520037

2015-02-15

楊君（1972—），男，高級工程師，碩士，研究方向為天然植物提取、感官組學。E-mail：yangjun@zjtobacco.com

*通信作者：蔣?。?978—），男，高級工程師，碩士，研究方向為香精香料化學分析。E-mail：jiangj@zjtobacco.com