雙酚A單克隆抗體的制備及酶聯(lián)免疫分析方法的建立

許 龍，章 英，朱立鑫，范 艷，賴 肖，孟 瑋，胡 娜，劉仁榮,*

（1.江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué) 院，江西 南昌 330013；2.南昌市疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330038）

雙酚A單克隆抗體的制備及酶聯(lián)免疫分析方法的建立

許 龍1，章 英2，朱立鑫1，范 艷1，賴 肖2，孟 瑋1，胡 娜1，劉仁榮1,*

（1.江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué) 院，江西 南昌 330013；2.南昌市疾病預(yù)防控制中心，江西 南昌 330038）

采用活潑酯法將 雙酚A的結(jié)構(gòu)類似物雙酚酸與載體蛋 白偶聯(lián)制備人工抗原，用制備的人工抗原免疫BALB/c小鼠，采用聚乙二醇法進(jìn)行細(xì)胞融合制備雙酚A單克隆抗體，成功獲得一株分泌抗 雙酚A單克隆抗體的細(xì)胞株3H1，經(jīng)鑒定抗體屬于IgG1亞型，輕鏈為κ，并建立了間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析法。線性范圍為1～50 ng/mL， 最低檢測(cè)限為0.43 ng/mL，半數(shù)抑制濃度為6.56 ng/mL。回收率為82.83%～101.94%，變異系數(shù)為2.94%～12.95%。該方法具有較高的靈敏度和特異性，具有良好的應(yīng)用前景。

雙酚A；單克隆抗體；酶聯(lián)免疫分析法

近年來(lái)，許多工業(yè)化學(xué)物質(zhì)被釋放到環(huán)境中，其中一些化學(xué)物質(zhì)具有類似體內(nèi)激素的作用，影響和干擾了生物體內(nèi)分泌統(tǒng)的正常功能，導(dǎo)致人和動(dòng)物的生殖系統(tǒng)發(fā)育不良，生育能力下降，并引起各種生理異常，這類物質(zhì)通常稱為“環(huán)境激素”[1]。雙酚A（bisphenol A，BPA）學(xué)名為2,2-二（4-羥基苯基）丙烷，屬于一種酚類雌激素。BPA是一種重要的化工原料，主要用于生產(chǎn)聚碳酸酯和環(huán)氧樹(shù)脂等高分子材料[2-3]。聚碳酸酯廣泛用于水瓶、嬰兒奶瓶、罐頭瓶等食品和飲料容器。環(huán)氧樹(shù)脂常用作一些金屬食品容器的內(nèi)壁涂層，防止食品腐蝕金屬容器內(nèi)壁[4]。這些食品包裝材料中微量的BPA可以遷移到食品和周圍環(huán)境中，通過(guò)食物鏈或生物鏈進(jìn)入生物體內(nèi)，對(duì)人和動(dòng)物的健康造成威脅[5]。近幾年研究表明，BPA可以影響生精細(xì)胞周期，干擾精子的正常產(chǎn)生，影響生殖功能。BPA也可以誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的增殖，具有潛在的免疫毒性。BPA還能誘發(fā)乳腺癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜異位等疾病[6-7]。因此，加強(qiáng)BPA的殘留檢測(cè)，對(duì)保護(hù)人類健康和生存環(huán)境具有重要意義。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于BPA殘留的檢測(cè)方法主要有：紫外分光光度法[8]、電化學(xué)法[9-10]、高效液相色譜-紫外法[11]、高效液相色譜-熒光法[12-14]、氣相色譜法-質(zhì)譜法[15-16]等。高效液相色譜-熒光法檢測(cè)食品中BPA殘留的檢測(cè)限可達(dá)到0.1～2ng/mL。這些傳統(tǒng)的儀器分析方法具有檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠等優(yōu)點(diǎn)，但其需要昂貴的儀器、復(fù)雜的操作和復(fù)雜的樣品前處理，不適用于大量樣品的快速檢測(cè)。而酶聯(lián)免疫分析（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法[17-19]具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，這對(duì)BPA的殘留檢測(cè)具有重要的意義。

本實(shí)驗(yàn)成功地合成了BPA人工抗原，制備了BPA的單克隆抗體，并初步建立了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，檢測(cè)BPA的殘留。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BPA標(biāo)準(zhǔn)品、卵清蛋白（ovalbumin，OVA）和羊抗小鼠酶標(biāo)二抗 美國(guó)Sigma公司；N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS） 美國(guó)Aladdin公司；雙酚酸（valeric acid，BVA） 日本Tokyo Kasei公司；四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）、1-乙基-3-（3-二甲基胺丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽（1-ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl) carbodiimide hydrochloride，EDAC） 中國(guó)生工生物公司；抗BPA單克隆抗體3H1由本實(shí)驗(yàn)室自制。

包被緩沖液：0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS，pH 7.4）；封閉液：取5 g脫脂奶粉溶于100 mL 50 ℃的蒸餾水；洗滌液：PBS T緩沖液即含0.05%吐溫-20的PBS；標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液：超純水。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600紫外分光光度計(jì) 上海尤尼柯公司；Multiskan MK3酶標(biāo)儀、WELLWASH VERSA洗板機(jī)美國(guó)Thermo公司；Milli-Q超純水系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司；Centrifuge 5804R型離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；酶標(biāo)板 美國(guó)Costar公司。

1.3 方法

1.3.1 BPA人工抗原的合成

參照文獻(xiàn)[20]加以改進(jìn)，以BVA作為BPA的半抗原引入羧基，稱取BVA 0.45 mg，NHS 1.49 mg和EDAC 2.28 mg溶于150 μL二甲基甲酰胺，17 ℃，130 r/min避光反應(yīng)16 h。反應(yīng)后所得溶液為A液。稱取5.8 mg OVA 溶于2 mL 0.13 mol/L NaHCO3溶液中，得到OVA溶液。將A液逐滴加入OVA溶液中，邊加邊攪拌，17 ℃，130 r/min避光反應(yīng)12 h。然后將反應(yīng)后的混合液轉(zhuǎn)入透析袋中，在4 ℃，0.01 mol/L pH 7.4的PBS中透析2 d，期間換液2 次，以去除未反應(yīng)的BVA等小分子物質(zhì)。透析后的偶聯(lián)物進(jìn)行紫外掃描。免疫抗原BVA-血藍(lán)蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）以相同的方法制備。

1.3.2 BPA單克隆抗體的制備與純化

第3次免疫后21 d對(duì)免疫效價(jià)較好的小鼠尾靜脈注射人工抗原加強(qiáng)免疫，3 d后，取脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在融合劑聚乙二醇作用下進(jìn)行細(xì)胞融合。在HAT完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，換HT完全培養(yǎng)基，觀察雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況，取培養(yǎng)上清液，用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法篩選分泌抗BPA單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。陽(yáng)性細(xì)胞經(jīng)有限稀釋法亞克隆3次的抗體陽(yáng)性率均為100%后，建立細(xì)胞株并用液氮凍存。取8～10 周齡BALB/c小鼠注射液體石蠟，0.6 mL/只，一周后每只注入1 mL BPA雜交瘤細(xì)胞3H1，7～10 d后采集腹水用辛酸-硫酸銨法[21]純化，純化后的抗體用紫外掃描測(cè)定其蛋白含量。最后用單克隆抗體分型試劑盒進(jìn)行亞型鑒定。

1.3.3 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法的建立

1.3.3.1 檢測(cè)抗原包被質(zhì)量濃度和抗體最佳稀釋比例的確定

用PBS將BVA-OVA分別稀釋至0.5、1、2、4、6 μg/mL，4 ℃包被過(guò)夜，PBST洗板4 次，每 孔加入320 μL 5 mg/mL脫脂奶37 ℃溫育2 h。洗板機(jī)洗板4 次，加入PBS稀釋的抗BPA單克隆抗體3H1，按照1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶1 28 000、1∶256 000、1∶512 000的比例倍比稀釋，進(jìn)行方陣滴定確定抗原的包被質(zhì)量濃度和抗體的最佳稀釋比例。

1.3.3.2 有機(jī)溶劑對(duì)抗原抗體結(jié)合的影響

用pH 7.4的 0.01 mol/L的PBS緩沖液稀釋包被抗原至最佳質(zhì)量濃度包被到酶標(biāo)板上，分別用含不同體積分?jǐn)?shù)甲醇溶液稀釋BPA標(biāo)準(zhǔn)品至系列質(zhì)量濃度，然后按間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法進(jìn)行測(cè)定，比較最大光密度值和IC50值，考察有機(jī)溶劑對(duì)抗原抗體結(jié)合的影響，確立標(biāo)準(zhǔn)品最佳的稀釋緩沖液。

1.3.3.3 抗體稀釋緩沖液pH值的優(yōu)化

用不同pH值（6.4、7.4、8.4、9.4）的PBS稀釋的抗體和最佳稀釋緩沖液稀釋的BPA標(biāo)準(zhǔn)品，按照間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法反應(yīng)，比較最大光密度值和IC50值的變化。

1.3.3.4 ELISA標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的建立

根據(jù)確定的抗原最佳包被質(zhì)量濃度和抗體的最佳稀釋比例，建立BPA間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。用PBS將BVA-OVA稀釋至最佳質(zhì)量濃度包被酶標(biāo)板，120 μL/孔，4 ℃包被過(guò)夜，用5 mg/mL的脫脂牛奶封閉。PBST洗板4 次，加入系列超純水稀釋的BPA（0、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100、200 ng/mL）和最佳稀釋比例的抗體各50 μL，混勻，37 ℃溫育40 min；洗板4 次后每孔加1∶2 500的酶標(biāo)二抗100 μL，37 ℃溫育40 min；洗板4 次，每孔加100 μL TMB顯色液37 ℃顯色8min；取出每孔加50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定OD450nm值。按式（1）計(jì)算各質(zhì)量濃度的結(jié)合率，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

式中：B0為未加BPA的OD450nm值；B為加BPA的OD450nm值。

1.3.3.5 交叉反應(yīng)率的測(cè)定

用超純水溶解不同質(zhì)量濃度的雙酚S、BVA、對(duì)苯二酚、鄰羥基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品，取50 μL進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定，按式（2）計(jì)算交叉反應(yīng)率：

1.3.3.6 加標(biāo)回收率的測(cè)定

以某品牌塑料瓶裝的礦泉水為樣品。用礦泉水配制質(zhì)量濃度為100 ng/mL的BPA加標(biāo)溶液。分別吸取BPA加標(biāo)溶液（100 ng/mL）1.25、2.5、12.5、50 mL于50 mL容量瓶中定容，混合搖勻，得到一系列不同質(zhì)量濃度的BPA加標(biāo)溶液，以礦泉水為對(duì)照樣品，分別按照間接ELISA法進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)質(zhì)量濃度平行測(cè)定5次，計(jì)算加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 BPA人工抗原的紫外掃描結(jié)果

采用活潑酯法將BVA與OVA偶聯(lián)，合成了人工抗原BVA-OVA。紫外分光光度計(jì)對(duì)BVA、OVA和BVA-OVA進(jìn)行掃描，結(jié)果見(jiàn)圖1。對(duì)比3條曲線可以看出，同質(zhì)量濃度的OVA和BVA-OVA偶聯(lián)物在280 nm左右均有特征吸收峰，而偶聯(lián)物在280 nm的峰高相對(duì)較高，且發(fā)生了一定的位移。這說(shuō)明BVA和OVA的特征吸收峰發(fā)生了疊加，因此可以判斷BVA與載體蛋白OVA偶聯(lián)成功。同理，由圖2可以判斷BVA與載體蛋白KLH偶聯(lián)成功。

圖2 BVA、KLH和其偶聯(lián)物的紫外掃描圖Fig.2 UV spectra of BVA, KLH and BVA-KLH

2.2 BPA單克隆抗體的制備

經(jīng)細(xì)胞融合，篩選得到一株分泌抗BPA單克隆抗體的細(xì)胞株，命名為3H1。分泌的單克隆抗體經(jīng)測(cè)定屬于IgG1亞型，輕鏈為κ鏈。注射雜交瘤細(xì)胞的小鼠，7 d左右小鼠腹部明顯膨脹，行動(dòng)遲緩。觀察小鼠狀況，采集腹水，辛酸-硫酸銨法純化腹水。腹水純化后，采用紫外分光光度計(jì)法計(jì)算抗體蛋白含量。根據(jù)公式[22]C/（mg/mL）=（1.45A280nm－0.74A260nm）×稀釋倍數(shù)，計(jì)算得到抗體蛋白質(zhì)量濃度為7.56 mg/mL。

2.3 包被抗原質(zhì)量濃度和抗體最佳稀釋比例的確定

采用方陣滴定法進(jìn)行間接ELISA測(cè)定，選擇光密度值為1.0左右時(shí)包被抗原的質(zhì)量濃度和抗體稀釋比作為最佳條件。在抗體稀釋度為1∶512 000時(shí)，包被抗原質(zhì)量濃度達(dá)到1 μg/mL后，對(duì)應(yīng)的光密度值隨抗原質(zhì)量濃度的增大變化不明顯，且光密度值達(dá)到1.0，因此選擇1 μg/mL為抗原的包被質(zhì)量濃度。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液的優(yōu)化

圖3 BPA稀釋液甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)ELISA檢測(cè)的影響Fig.3 Effect of methanol concentration of BPA diluent on ELISA

從圖3可以看出，隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增大，ELISA最大光密度值無(wú)明顯變化，但ELISA方法IC50值逐漸增大，表明高體積分?jǐn)?shù)的甲醇對(duì)BPA抗體競(jìng)爭(zhēng)抑制效率有明顯影響，因此選用超純水作為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液。

2.5 抗體稀釋緩沖液pH值的優(yōu)化

從圖4可以看出，隨著pH值的增大，最大光密度值逐漸降低，IC50值也逐漸減小，可能是由于較高的pH值會(huì)對(duì)抗原抗體的結(jié)合具有干擾作用，雖然pH值為6.4時(shí)，光密度值最大，但I(xiàn)C50值最大，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)，pH值為7.4時(shí)相關(guān)系數(shù)最大，所以選擇緩沖液pH值為7.4比較合適。

圖4 緩沖液pH值對(duì)ELISA檢測(cè)的影響Fig.4 Infl uence of buffer pH on ELISA

2.6 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

BVA-OVA包被質(zhì)量濃度為1 μg/mL，抗體最終稀釋比例為1∶512 000，酶標(biāo)二抗?jié)舛葹?∶2 500時(shí)，建立BPA間接競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線。抗體在1～50 ng/mL之間具有良好的 線性，線性方程為y=－0.339x＋1.116，相關(guān)系數(shù)R2=0.995，抑制率為50%時(shí)，BPA的質(zhì)量濃度為6.56 ng/mL。一般選擇抑制率為10%對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為最低檢測(cè)限，該方法的最低檢測(cè)限，即IC10為0.43 ng/mL。

2.7 交叉反應(yīng)率的測(cè)定

將單抗分別與雙酚S、BVA、對(duì)苯二酚和鄰羥基苯甲酸進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA，測(cè)定IC50值，并計(jì)算交叉反應(yīng)率，結(jié)果見(jiàn)表1。雙酚S交叉反應(yīng)率為0.29%，BVA交叉反應(yīng)率為0.25%，對(duì)苯二酚和鄰羥基苯甲酸的交叉反應(yīng)率均小于0.066%。4種物質(zhì)的交叉反應(yīng)率均小于1%，對(duì)BPA的檢測(cè)幾乎無(wú)干擾。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)室制備的3H1單克隆抗體對(duì)BPA具有較好的特異性。

表1 交叉反應(yīng)率的測(cè)定Table1 Cross-reactivity of the assay

2.8 加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果

表2 BPA加標(biāo)回收率Table2 Recovery rates of BPA in water

采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)礦泉水中BPA含量，以未檢出BPA的礦泉水進(jìn)行BPA加標(biāo)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表2，顯示BPA回收率為82.83%～101.94%，變異系數(shù)為2.94%～12.95%。

3 討論與結(jié)論

BPA作為重要的化工原料，廣泛應(yīng)用于生活中。因其具有多種毒性作用，對(duì)人類的健康造成嚴(yán)重的危害。世界各國(guó)針對(duì)BPA的殘留制定了相應(yīng)的殘留標(biāo)準(zhǔn)并建立了各種分析方法，進(jìn)行嚴(yán)格監(jiān)管。目前，ELISA方法已被廣泛應(yīng)用于BPA的快速檢測(cè)，而建立高靈敏的ELISA法的關(guān)鍵在于特異性抗體的制備。如果要制備高親和性和特異性的抗體，選用的半抗原分子的反應(yīng)基團(tuán)應(yīng)遠(yuǎn)離其特征結(jié)構(gòu)，如羧基、氨基、羥基、苯環(huán)和雜環(huán)等，使半抗原特征結(jié)構(gòu)充分暴露。BPA分子上具有兩個(gè)羥基基團(tuán)，在半抗原分子的兩個(gè)苯環(huán)上，不適合用作反應(yīng)基團(tuán)與載體大分子偶聯(lián)制備人工抗原。

本研究選用了BPA的結(jié)構(gòu)類似物BVA作為半抗原引入了羧基，采用活潑酯法制備了人工抗原，使BPA分子中的特征結(jié)構(gòu)充分暴露。用抗原免疫BALB/c小鼠，對(duì)免疫抗原的劑量和免疫程序進(jìn)行了優(yōu)化，首次免疫抗原劑量為80 μg/只，隔3周進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫劑量為55μg/只，共免疫3 次。第3次免疫后篩選出血清效價(jià)和特異性較高的小鼠。采用聚乙二醇法進(jìn)行細(xì)胞融合，經(jīng)過(guò)3次篩選，成功獲得一株分泌抗BPA單克隆抗體的細(xì)胞株3H1，并應(yīng)用制備的單克隆抗體初步建立了BPA的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，線性范圍為1～50 ng/mL，最低檢測(cè)限為0.43 ng/mL，IC50為6.56 ng/mL。回收率為82.83%～101.94%，變異系數(shù)為2.94%～12.95%。本方法簡(jiǎn)便、靈敏、快速，可用于檢測(cè)水體中的BPA污染情況，具有較好的應(yīng)用前景。

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Preparation of Monoclonal Antibody for the Detection of Bisphenol A by Enzyme-Linked Immunoassay

XU Long1, ZHANG Ying2, ZHU Lixin1, FAN Yan1, LAI Xiao2, M ENG Wei1, HU Na1, LIU Renrong1,*
(1. College of Life Science, Jiangxi Science and Technology Normal University, Nanchang 330013, China; 2. Nanchang Center for Disease Control and Prevention, Nanchang 330038, China)

4,4-Bis (4-hydroxyphenyl) valeric acid (BVA), a derivative of bisphenol A (BPA), was chosen as the hapten to prepare the artifi cial antigen. An active ester method was used for coupling BPA hapten with keyhole limpet hemocyanin (KLH) and ovalbumin (OVA), respectively. BALB/c mice were immunized with the immune antigen to produce antibo dy. After cell fusion with PEG method, the hybridoma cell lines generating anti-BPA monoclonal antibodies were obtained. The monoclonal antibody was identifi ed as IgG1 subtype with κ light chain. An indirect competitive enzyme-linked immunoassay (ELISA) was set up using the monoclonal antibody. The linear range of the inhibition curve was between 1 and 50 ng/mL. The limit of detection was 0.43 ng/mL, and the IC50value was 6.56 ng/mL. The recovery rates of BPA in water ranged from 82.83% to 101.94% with variation coeffi cients of 2.94%-12.95%.The propose d immunoassay offer s a great potential for sensitive and specifi c detection of BPA in food safety monitoring.

bisphenol A; monoclonal antibody; enzyme-linked immunoassay

TQ323.5

A

1002-6630（2015）20-0202-05

10.7506/spkx1002-6630-201520039

2014-12-04

國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（81360429）；江西省高等學(xué)校科技落地計(jì)劃項(xiàng)目（GJJ13573/13574）；

南昌市科技計(jì)劃項(xiàng)目（洪財(cái)企[2012]，37號(hào)-23）

許龍（1990—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)。E-mail：xu_lon@163.com

*通信作者：劉仁榮（1969—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)。E-mail：lilirenrong@hotmail.com