響應面法優化枯草芽孢桿菌B91發酵培養基

孟利強，趙曉宇，陳靜宇，李 晶，張淑梅，曹 旭，胡基華，沙長青

(1.黑龍江省科學院微生物研究所黑龍江省生物工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱150010;2.黑龍江省科學院高技術研究院，黑龍江哈爾濱150020;3.黑龍江省科學院條件財務處，黑龍江哈爾濱150001)

枯草芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性好氧細菌，能產生蛋白酶、抗生素、抗菌多肽等多種物質，已被廣泛應用于環保、畜牧和生物防治等領域［1］。枯草芽孢桿菌的微生態制劑可以作為飼料或肥料的添加劑來防治動物疾病和植物病害，制劑中活菌數是衡量其質量的重要指標［2］。而微生態制劑中的活菌數會隨著其存放時間的延長而減少，最終影響其使用效果，這一問題可以通過提高芽孢桿菌制劑的芽孢比例得以緩解［3］。芽孢是芽孢桿菌的休眠體，具有多種抗逆特性，可以延長微生態制劑的保存期并保證其使用效果［4］。

在工業化生產中，由于液體發酵的各個工藝參數易于控制，已成為主要的發酵手段，然而在枯草芽孢桿菌的生產過程中由于芽孢形成不穩定和菌數低等因素，給實際生產帶來不便［5］。枯草芽孢桿菌B91是黑龍江省生物工程重點實驗室的自有菌株，是一株具有光譜抑制植物病原真菌能力的細菌，能夠防治多種植物病害，具有廣泛的應用前景。筆者對其發酵培養基進行優化，以期實現該菌株的高密度培養的同時提高芽孢形成率，為其工業化生產提供支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗菌種 枯草芽孢桿菌B91由黑龍江省生物工程重點實驗室保存。

1.2 培養基

1.2.1 斜面培養基。葡萄糖10 g/L，酵母膏5 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉3 g/L，K2HPO42 g/L，瓊脂15 g/L，初始 pH 為7.2 ～7.5。

1.2.2 種子培養基。葡萄糖10 g/L，酵母膏5 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉 3 g/L，K2HPO42 g/L，CaCO32 g/L，初始 pH 為7.2 ～7.5。

1.2.3 基礎發酵培養基。葡萄糖10 g/L，酵母膏5 g/L，氯化鈉 3 g/L，K2HPO42 g/L，MgSO40.2 g/L，MnSO40.01 g/L，CaCO32 g/L，初始 pH 為7.2 ～7.5。

上述培養基滅菌條件均為濕熱滅菌:121℃，20 min。

1.3 培養方法

1.3.1 種子活化。將枯草芽孢桿菌B91轉接到斜面培養基上，30℃培養24 h。

1.3.2 種子培養。挑一環斜面種子接種于250 ml三角瓶種子培養基中，三角瓶裝液量為20 ml，30℃、75 r/min振蕩培養20 h。

1.3.3 發酵培養。將種子液以2%接種量接種于三角瓶發酵培養基中，三角瓶裝液量為50 ml，30℃、180 r/min搖床培養48 h。

1.4 芽孢計數方法 將待測樣品置于80℃水浴處理15 min，使未形成芽孢的菌體失活，自然冷卻后采用平板菌落計數法計數，所得結果即為待測樣品中的芽孢數［6］。

1.5 Plackett-Burman設計 采用Plackett-Burman進行試驗設計，篩選基礎發酵培養基中的顯著因子，對培養基的7個組分，即葡萄糖(A)、酵母膏(B)、氯化鈉(D)、K2HPO4(E)、MgSO4(G)、MnSO4(H)、CaCO3(K)進行全面考察。選擇10因子2水平的試驗設計，增加3個空項C、F、J來估計試驗誤差，每個因子取高低2個水平，且高水平是低水平的1.5倍(表1)。

表1 Plackett-Burman設計因子與水平

1.6 爬坡試驗 通過對Plackett-Burman設計的試驗結果進行分析，確定主要因子，根據回歸方程各因子的系數來確定主要因子的爬坡路徑和步長［7］。改變各主要因子在基礎發酵培養基中的質量濃度，使其成梯度變化，檢測各個梯度下發酵液芽孢數量，快速確定最大響應值的區域。

1.7 響應面分析 Plackett-Burman設計確定了影響B91菌株發酵芽孢濃度的3個主要因子，爬坡試驗確定了3個主要因子響應區域的中心點，采用Box-Behnken的中心組合設計原理在主要因子的響應區各取3個水平，設計3因素3水平的響應面分析試驗。

1.8 數據分析 一個處理包含3個平行試驗，取值為3個平行試驗的均值。Plackett-Burman設計采用Minitab 16軟件完成，Box-Behnken設計的響應面分析由Design-Expert 8.0完成。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman設計篩選顯著因子 采用Plackett-Burman設計對基礎發酵培養基的7個組分進行分析，各組分分別取高低2個水平(表2)，各因子水平方差分析結果見表3。

由表3中P值的大小可以判定，培養基中各因子對B91菌株發酵液芽孢濃度影響的重要性排序為A＞B＞H＞G＞D＞E＞K，即葡萄糖、酵母膏和MnSO4的影響較為突出，由相關系數可以判定葡萄糖和酵母膏對芽孢數量的影響呈現正效應，而MnSO4呈現負效應。這些效應關系由回歸模擬方程表示為Y=19.9+1.98A+1.82B －0.400D+0.267E+0.583G－1.18H －0.150K，R2=0.956 4，這表明該方程式擬合較好。

表2 Plackett-Burman設計及響應值

表3 Plackett-Burman設計顯著因子分析

2.2 爬坡試驗 爬坡試驗是一種快速逼近最大響應值穩定響應區的方法，根據Plackett-Burman設計篩選出的顯著因子及其相關系數來設計它們的爬坡路徑和步長(表4)。其中第2組試驗發酵芽孢濃度最大，即當葡萄糖濃度為10.0 g/L，酵母膏濃度為7.0 g/L，MnSO4濃度為 0.010 0 mg/L 時發酵芽孢濃度達到最大值，所以以此為中心點進行響應面試驗分析。

表4 爬坡試驗設計及結果

2.3 響應面試驗分析 確定了顯著因子的最適濃度區域之后，即以葡萄糖 10.0 g/L，酵母膏 7.0 g/L，MnSO40.010 0 mg/L為中心點進行響應面分析試驗，各因素代碼和水平見表5。根據Box-Behnken中心組合設計原理在3個主要因素的響應區各取3個水平，設計3因素3水平的響應面試驗，每個處理設定3個重復試驗，響應面試驗設計及試驗結果見表6。根據表6結果，以芽孢濃度為響應值，采用Design-Expert 8.0 分析。

方差分析結果表明，該模型的一次項和二次項對芽孢濃度的影響均顯著，而交互作用對芽孢濃度的影響不顯著;回歸模型的P值為0.000 1，表明模型是顯著的，而失擬項的P值為0.217 8，失擬不顯著;模型的決定系數 R2=0.978 4，說明模型達到較好的擬合程度［8－9］。經分析軟件回歸擬合得到該模型的回歸方程:

Y=41.16 －2.81A －1.29B+1.20C －1.12AB+0.55AC+2.65BC －4.17A2 －7.62B2－5.74C2

為解得該回歸方程的極值點，對其各自變量分別求一階偏導，得到三元一次方程組，解出該模型的極值點，從而計算出對應因素的取值:葡萄糖9.35 g/L，酵母膏 6.93 g/L，Mn-SO410.16 mg/L，此時模型的理論最優芽孢濃度為41.695 4×108cfu/ml。

根據擬合回歸方程采用Design-Expert 8.0分析，繪出主要因素相應的等高線和相應的響應面分析圖(圖1～3)。每個響應曲面能夠反映出2個主要因素之間的相互作用，在第3個因素固定在最優值不變的情況下，隨著另外2個因素的逐漸增加，芽孢濃度呈先增加后減小的趨勢，而曲面的頂點即為芽孢濃度的最大值點［10］。

2.4 驗證試驗 根據響應面分析結果，枯草芽孢桿菌B91菌株芽孢濃度最優極值為葡萄糖9.35 g/L、酵母膏 6.93 g/L、MnSO410.16 mg/L，預測最優值為41.695 4 ×108cfu/ml。為了驗證這一結果的有效性，按照上述分析結果進行重復試驗，檢測結果為(41.89 ±0.21)×108cfu/ml，與預測值相近，說明該模型擬合的有效性。枯草芽孢桿菌B91菌株的最優培養基配方為:葡萄糖9.35 g/L，酵母膏6.93 g/L，氯化鈉3 g/L，K2HPO42 g/L，MgSO40.2 g/L，MnSO410.16 mg/L，CaCO30.2 g/L。

3 結論與討論

培養基的優化是微生物菌種從實驗室走向工業化生產的第一步，而對于芽孢桿菌微生態制劑而言，其中的芽孢含量才是其質量的保證，該研究從實驗室自有枯草芽孢桿菌B91的培養基優化入手，提高其發酵產物細胞濃度和芽孢形成率。在培養基的優化過程中，Plackett-Burman設計可以從眾多的培養基組成成分中篩選出對目標產物影響最為顯著的幾個因子。而響應面分析法可以同時對響應值的幾個變量進行回歸分析，能分析多種因素間的相互作用，同時能通過回歸方程預測響應值的最優值［11－12］。目前，國內外許多研究者采用該方法對不同微生物的培養基進行了優化，均獲得了較為理想的試驗結果。李志華［13］利用響應面法對谷氨酸棒桿菌CN1021的發酵培養基進行了優化，結果谷氨酸產量比未優化的發酵培養基提高了22.75%;王永宏等［14］利用響應面法對YL001菌株的培養基進行了優化，結果菌株抗菌活性達268.9 U/ml，與預測值相符;黃麗金等［15］采用響應面方法對德氏乳桿菌保加利亞亞種LB14增殖培養基進行了優化，在優化培養基中LB14的菌體濃度比優化前提高了近5倍;Muthu等［16］利用響應面法優化了嗜鹽細菌VKMM 013的培養基，使其菌體濃度提高了2.4倍。

該研究采用Plackett-Burman設計從B91菌株基礎發酵培養基中的7個組分中篩選出3個顯著因子:葡萄糖(A)、酵母膏(B)和MnSO4(C)，然后利用爬坡試驗快速逼近最大響應值的穩定響應區，并用響應面分析法的Box-Behnken設計確定顯著因子的最優配比:葡萄糖9.35 g/L、酵母膏 6.93 g/L、MnSO410.16 mg/L。最終確定了枯草芽孢桿菌B91的最優培養基配方:葡萄糖9.35 g/L，酵母膏6.93 g/L，氯化鈉3 g/L，K2HPO42 g/L，MgSO40.2 g/L，MnSO410.16 mg/L，Ca-CO30.2 g/L。經驗證試驗檢測結果為(41.89±0.21)×108cfu/ml，與預測值相近，說明該模型擬合的準確性和試驗結果的有效性。

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