桉樹無性系雷11組織培養(yǎng)技術(shù)研究

楊衛(wèi)星，盧開成，安冰(廣西國有派陽山林場，廣西寧明532500)

桉樹(Eucalyptus)為桃金娘科(Myrtlefamily)桉屬常綠高大喬木，原產(chǎn)地大多數(shù)在澳大利亞［1］。桉樹喜光好濕、耐旱畏寒、抗熱抗病，因其生長迅速、適應(yīng)性強(qiáng)、技術(shù)成熟、用途廣泛且經(jīng)濟(jì)效益優(yōu)良，而被世界上百余個(gè)國家和地區(qū)廣泛引種栽培，是世界著名的三大速生樹種之一。桉樹引種我國已有百年歷史，在我國林業(yè)發(fā)展中占有舉足輕重的地位［2］。建立桉樹組織培養(yǎng)與再生系統(tǒng)，既可為商品化大規(guī)模育苗做準(zhǔn)備，又有助于建立轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)，為利用轉(zhuǎn)基因手段改良桉樹性狀奠定良好的基礎(chǔ)［3］。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 所采用桉樹無性系雷11(E.leizhou No 11)為材料，雷11是雷州林業(yè)局研究開發(fā)的優(yōu)良無性系，具有生長迅速、抗病性強(qiáng)等特點(diǎn)［4］。

1.2 試驗(yàn)方法 外植體的取材與滅菌:選用三年生桉樹半木質(zhì)化萌發(fā)莖段為外植體，取材時(shí)間宜天氣晴朗3 d后，10:00～15:00采集萌芽條，材料用飽和洗衣粉溶液刷洗干凈后備用。外植體消毒采用2個(gè)處理:①75%乙醇30 s+0.1%氯化汞7 min;②15%新潔爾滅30 min+10%次氯酸鈉10 min，滅菌后的材料切成1～2 cm長的莖段，每段帶1個(gè)節(jié)接種到培養(yǎng)基上，置于光強(qiáng)3 000 lx、溫度25℃誘導(dǎo)不定芽。外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基分別設(shè)3個(gè)處理:①M(fèi)S+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L;②MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.4 mg/L;③MS+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.3 mg/L。

增殖培養(yǎng)基分別設(shè)3個(gè)處理:①M(fèi)S+6-BA 0.7 mg/L+NAA 0.35 mg/L;②MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.25 mg/L;③MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.15 mg/L。培養(yǎng)條件:溫度24～26 ℃，光照12～14 h/d，光強(qiáng)2 500～3 000 lx。

生根培養(yǎng)基分別設(shè)3個(gè)處理:①1/2MS+IBA 0.3 mg/L+ABT1 0.6 mg/L;②1/2MS+IBA 0.2 mg/L+ABT 10.4 mg/L;③1/2MS+IBA 0.1 mg/L+ABT 10.2 mg/L。培養(yǎng)條件:溫度24～26 ℃，光照12～14 h/d，光強(qiáng)3 000～3 500 lx。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體的取材與滅菌 由表1可知，滅菌方式②比①萌芽率高13%，灼傷率低13%，滅菌后的外植體生長較好、萌發(fā)較快，有一定優(yōu)勢，但污染率較①高16%。這說明處理①可以有效降低外植體的污染率，但對外植體起到明顯的傷害作用，易出現(xiàn)褐化，導(dǎo)致其死亡。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)使用10%次氯酸鈉滅菌時(shí)，將10 min滅菌過程分成2次5 min滅菌過程(中間使用無菌水清洗數(shù)次)，對黃化、白化現(xiàn)象有一定抑制作用，且滅菌效果不變。以后的試驗(yàn)中，均以處理②為消毒方式。

表1 2種外植體消毒方式對比

2.2 桉樹組織培養(yǎng)體系的建立

2.2.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)基。由表2可知，誘導(dǎo)培養(yǎng)基的激素濃度以處理②效果最佳，增殖倍數(shù)適宜，達(dá)到2～3個(gè)芽，芽的長勢及狀態(tài)良好，萌芽率高，生長較快;處理①激素濃度過高，萌芽率較②低8%，且出現(xiàn)褐化玻璃化，難以馴化，即使很快擴(kuò)大繁殖，也會成為無效芽;處理③激素濃度偏低，萌芽率較②低17%，芽質(zhì)量好，但生長慢，數(shù)量少，降低了擴(kuò)繁速度，對育苗生產(chǎn)進(jìn)度有所影響。

2.2.2 增殖培養(yǎng)基。由表3可知，增殖培養(yǎng)基的激素溶度以處理②效果最佳，增殖倍數(shù)適宜，達(dá)到3.96 cm，芽的長勢及狀態(tài)良好，生長旺盛，莖粗葉厚;處理①激素濃度過高，增殖個(gè)數(shù)較②低58.9%，生長較弱，芽點(diǎn)過密，基部易形成愈傷團(tuán)塊;處理③激素濃度偏低，萌芽率較②低52%，莖葉細(xì)長，長勢變?nèi)酢＜刺幚恝跒樽罴言鲋撑囵B(yǎng)基。

表2 不同外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基對比

表3 不同外植體增殖培養(yǎng)基對比

2.2.3 生根培養(yǎng)基。由表4可知，生根培養(yǎng)基的激素濃度以處理②效果最佳，接種21 d后，根系發(fā)達(dá)，達(dá)到7.45 cm，側(cè)根繁多，苗木生長旺盛，長勢均一，移栽后成活率可達(dá)95%;處理①激素濃度過高，苗高較②低73.4%，根長較②低55.7%，生根率低，易出現(xiàn)培養(yǎng)基褐化、根基部膨大現(xiàn)象，部分不生根，苗木較弱，長勢參差不齊，移栽后長勢較弱，成活率低;處理③激素濃度偏低，苗高較②低68.2%，根長較②低68.3%，生根率低，根系較弱，側(cè)根少，苗木生長緩慢，細(xì)弱，長勢參差不齊，移栽后成活率低，生長較慢。

表4 不同生根培養(yǎng)基對比

3 結(jié)論與討論

外植體采集后，飽和洗衣粉水刷洗干凈的預(yù)處理方法效果最佳。采集后及時(shí)進(jìn)行清洗消毒并接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，可極大減少剪口被病菌污染幾率，保持枝條的活性，從而降低污染率，提高萌芽率，達(dá)到事半功倍的效果。外植體消毒使用乙醇和氯化汞消毒一次的污染率最低，但易灼傷苗木，出現(xiàn)培養(yǎng)基褐化現(xiàn)象;新潔爾滅和次氯酸鈉污染率次之，但基本無灼傷，萌芽率高，萌發(fā)較快。實(shí)際操作時(shí)，要注意細(xì)節(jié)，掌握要領(lǐng)，動(dòng)作干凈利落，可有效地降低污染率，這與其他桉樹外植體研究類似［5］。

不同濃度激素對外植體誘導(dǎo)有顯著影響，處理②為最佳培養(yǎng)基配方，接種7～10 d后芽開始萌動(dòng)，12 d左右基部有綠色突起出現(xiàn)，20～25 d誘導(dǎo)出芽。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，激素濃度過高，易發(fā)生畸形并形成白色松散的愈傷組織，濃度過低，又影響萌動(dòng)，這與相思樹等其他樹種的組織培養(yǎng)有相似性［6］。在增殖培養(yǎng)時(shí)，激素濃度過高，也會出現(xiàn)畸形、玻璃化等現(xiàn)象，處理②為最佳配方，可得到最多的有效芽。

在工廠化生產(chǎn)中，要掌握好暗培養(yǎng)、弱光培養(yǎng)及自然光培養(yǎng)的時(shí)間，才能夠獲得生長健壯、增殖倍數(shù)適宜的無菌芽，建立有效的無菌芽繁殖體系，生產(chǎn)出合格的苗木，在類似文獻(xiàn)中，也得到了同樣的結(jié)論［5］。

在生根培養(yǎng)試驗(yàn)中，處理②為最佳配方，接種3 d后芽基部開始形成根原基突起，5～6 d后出現(xiàn)小根，19～21 d后長出發(fā)達(dá)的根系，側(cè)根多而密，移栽成活率高。桉樹的根系發(fā)育是一個(gè)喜光過程，尤以自然光最佳，根系發(fā)育良好的同時(shí)，莖葉發(fā)育也很健壯，且培育后期木質(zhì)化程度好，可大幅度提高移栽后成活率。在工廠化生產(chǎn)中，如何減輕莖段基部褐變是生根研究的關(guān)鍵之一［7－8］，為了抑制培養(yǎng)基褐化，可適當(dāng)加入抗壞血酸(0.01～0.02 mg/L為宜)和活性炭(40 mg/L為宜)，加入過少無法抑制褐化，加入過量則容易影響到pH。

無菌芽誘導(dǎo)和無菌體系的建立，是一個(gè)復(fù)雜艱難的過程，是最核心的技術(shù)環(huán)節(jié)。隨著桉樹種植的不斷發(fā)展，組培培養(yǎng)技術(shù)不斷取得新的突破和進(jìn)展［9］，如何加快誘導(dǎo)速度、縮短培養(yǎng)周期、降低生產(chǎn)成本，特別是優(yōu)良無性系的選育推廣，都有待更多的試驗(yàn)和研究。

［1］祁述雄.中國桉樹［M］.2 版.北京:中國林業(yè)出版社，2002.

［2］祁述雄.中國引種桉樹與發(fā)展現(xiàn)狀［J］.廣西林業(yè)科學(xué)，2006，35(4):250－252.

［3］謝耀堅(jiān).桉樹組培培養(yǎng)研究進(jìn)展［J］.世界林業(yè)研究，2000，13(6):14－16.

［4］黃宏林，陳馬興，何普興，等.桉樹枝癭姬小蜂危害對無性系雷11的影響［J］.桉樹科技，2013，30(2):26 －28.

［5］鄧海群，莫繼有，玉首杰，等.尾巨桉家系外植體誘導(dǎo)技術(shù)［J］.桉樹科技，2011，28(1):27 －29.

［6］蔡玲，王以紅，吳幼媚，等.五種相思樹組織培養(yǎng)研究［J］.廣西林業(yè)科學(xué)，2003，32(1):27 －29.

［7］郭洪英，陳炙，楊曉蓉，等.影響桉樹組培苗根系發(fā)育關(guān)鍵因子的研究［J］.四川林業(yè)科學(xué)，2008，29(1):20 －26.

［8］歐陽晶.桉樹組培快繁中存在的問題與對策［J］.福建林業(yè)科技，2006，33(1):203－206.

［9］楊民勝，李天會.中國桉樹研究現(xiàn)狀與科學(xué)經(jīng)營［J］.桉樹科技，2005，22(2):1－6.