焦化廢水中降解酚優(yōu)勢(shì)菌分離鑒定

王 雙 (山西大地復(fù)墾環(huán)保工程設(shè)計(jì)有限公司，山西太原030000)

高濃度含酚廢水(苯酚濃度高于500 mg/L)過去一直采用物理回收處理，但由于存在溶劑損失、吸附劑再生困難等原因而不經(jīng)濟(jì)，并且還會(huì)產(chǎn)生二次污染。相對(duì)于物理回收處理的方法而言，生物法具有經(jīng)濟(jì)、高效、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)，利用生物強(qiáng)化技術(shù)的微生物菌群高效分解能力，降解細(xì)菌的應(yīng)用已經(jīng)越來越多地受到人們的重視［1－6］。

近幾十年的研究表明，有很多微生物參與了有毒有機(jī)污染物的降解，所研究的這些微生物中對(duì)含酚類污染物有明顯降解作用的經(jīng)鑒定主要有以下幾種:藻類(Alga Ochromaonas)、酵母菌(Yeast trichosporon)、根瘤菌(Rhizobia)、芽孢桿菌(Bacillus sp.)、反硝化菌(Denitrifying bactreia)、真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligens eutrophus)、有假單胞菌(Pesudonomas sp.)、醋酸鈣不動(dòng)桿菌(A.calcoaceticus)等菌屬［7］。

例如楊彥希等就從煉油廠嚴(yán)重污染的污水和土壤中分離篩選到12株假絲酵母及絲胞酵母能以苯酚為唯一碳源生長，24～28 h內(nèi)降解苯酚質(zhì)量濃度最高可達(dá)1 200 mg/L以上，其中一菌株降解苯酚質(zhì)量濃度最高可達(dá)1 700 mg/L［8］。李焱采用雙親滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)選育出一株高效苯酚降解菌株，定名為Pseudomonas stutzri JFL 2008，比出發(fā)菌株降解苯酚能力提高20%，能降解苯酚的最高濃度為1 800 mg/L［9］。狄軍貞篩選出的假單胞菌GPS-1在2 000 mg/L的高苯酚濃度下，15 h降解率達(dá)93.16%［10］。從以上的試驗(yàn)可知，通過篩選菌株引入高降解活性菌種能提高含酚廢水的降解率，但如何使這些優(yōu)良菌株長期的在生物處理系統(tǒng)中占優(yōu)勢(shì)并保持其高降解活性是要解決的主要問題，而且提高降解速率是生物處理含酚廢水的一個(gè)關(guān)鍵問題。

1 材料與方法

1.1 菌源 取自中煤龍華哈爾濱煤化工有限公司廢水處理系統(tǒng)的活性污泥。

1.2 培養(yǎng)基 無機(jī)培養(yǎng)基:MgSO4·H2O 0.2 g、FeSO4·H2O 0.1 g、MnSO4·H2O 0.1 g、CaCl20.2 g、K2HPO40.5 g、KH2PO40.5 g、(NH4)2SO40.45 g、NaCl 0.1 g、葡萄糖 2 g、水1 000 ml;有機(jī)培養(yǎng)基:牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂20 g、水1 000 ml、調(diào)節(jié)pH 7±1(若制備固體培養(yǎng)基則加入瓊脂20 g);篩選培養(yǎng)基:MgSO4·H2O 0.2 g、FeSO4·H2O 0.1 g、MnSO4·H2O 0.1 g、CaCl20.2 g、K2HPO40.5 g、KH2PO40.5 g、(NH4)2SO40.45 g、NaCl 0.1 g、酚、調(diào)節(jié) pH 7 ±1。

1.3 試驗(yàn)儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱，CHA-S氣浴恒溫振蕩器，YXQ·SG46·280SA手提式壓力蒸汽滅菌器，精密電子天平，CJ-1D潔凈工作臺(tái)，PHS-3C精密pH計(jì)，721分光光度計(jì)。

1.4 滅菌條件 ①高壓蒸汽滅菌:小件玻璃器皿、培養(yǎng)基等采用濕式高壓蒸汽滅菌。這種滅菌方式可以達(dá)到徹底的滅菌。滅菌條件:0.103 MPa，121℃，20 min。②紫外滅菌無菌操作臺(tái):采用紫外滅菌方式，用紫外燈滅菌30 min。該種方式對(duì)空氣進(jìn)行滅菌，操作簡單方便，效果不錯(cuò)。

1.5 酚降解菌株的篩選 目前，所進(jìn)行試驗(yàn)研究的大部分優(yōu)勢(shì)降酚菌種主要以單一一種酚為基質(zhì)進(jìn)行篩選，而在實(shí)際應(yīng)用中單一酚的情況比較少，取而代之的則是混合酚的基質(zhì)條件，這樣致使所獲得菌種在實(shí)際應(yīng)用中對(duì)混合酚耐受力差，適應(yīng)其環(huán)境緩慢，降解率不能得到快速提高，在實(shí)際應(yīng)用中效果大打折扣，遠(yuǎn)不如在試驗(yàn)小試時(shí)得到的去除率效果明顯。在以實(shí)際工程為依據(jù)的基礎(chǔ)上，該試驗(yàn)將苯酚、甲基酚、二甲基苯酚、苯二酚按照30∶10∶10∶25的比例來配制篩選培養(yǎng)基，得到了一株能夠適應(yīng)高酚及混合酚條件的菌株。篩選過程如下:

取中煤龍華哈爾濱煤化工有限公司廢水處理系統(tǒng)的污泥廢水混合物，此時(shí)的廢水水質(zhì):COD 1 180 mg/L、酚濃度855 mg/L、氨氮濃度45.88 mg/L、pH 7±1、溫度35 ～40 ℃，取此廢水1 000 ml并在35℃的條件下曝氣48 h。將曝氣48 h后的泥水混合物沉降30 min，取上層澄清后的菌懸液100 ml，按照篩選培養(yǎng)基的比例投加藥劑，攪拌均勻，在氣浴恒溫振蕩器中以30℃、150 r/min的速度恒溫振蕩24 h。24 h后取振蕩的菌懸液10 ml投加到濃度為200 mg/L的篩選培養(yǎng)基中繼續(xù)在30℃、150 r/min的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。重復(fù)上一步操作，每次增加篩選培養(yǎng)基中酚濃度200 mg/L，直至達(dá)到1 000 mg/L。取經(jīng)過1 000 mg/L高酚濃度篩選后的菌懸液，利用有機(jī)固體培養(yǎng)基進(jìn)行平板劃線分離純化培養(yǎng)直至獲得單個(gè)菌落。將所獲得的單個(gè)菌落進(jìn)行有機(jī)富集培養(yǎng)。

1.6 酚降解菌株的分子鑒定 微生物分子生態(tài)學(xué)與傳統(tǒng)的以純培養(yǎng)為基礎(chǔ)的技術(shù)相比較，最明顯的一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于微生物分子生態(tài)學(xué)是利用分子生物學(xué)的方法，直接提取環(huán)境樣品中的總DNA，然后在分子的水平上對(duì)其微生物區(qū)系進(jìn)行解析。隨著16S rDNA方法的發(fā)展，它逐漸被應(yīng)用于對(duì)環(huán)境樣品的微生物進(jìn)行鑒定和分類［11－13］，但是環(huán)境樣品和純培養(yǎng)樣品相比成分更加復(fù)雜，提取DNA和雜交等試驗(yàn)的要求條件更加苛刻。而與16S rDNA比較，16S rRNA基因序列為1 550 bp左右，由保守區(qū)和可變區(qū)組成，通常編碼酶的基因不像16S rRNA基因這樣具有不可替代的作用，因此16S rRNA基因在進(jìn)化上相對(duì)保守，并且由于16S rRNA基因在細(xì)菌中是普遍存在的，所以可以通過對(duì)比其序列的相似性來鑒定它們之間的親緣關(guān)系［14］。目前，16S rRNA基因序列和功能基因序列被廣泛地用來進(jìn)行微生物多樣性的研究，該技術(shù)已發(fā)展成為純培養(yǎng)微生物以及環(huán)境微生物分類和鑒定的一個(gè)有力工具。對(duì)于純化培養(yǎng)后降解酚優(yōu)勢(shì)菌，用PCR方法擴(kuò)增分離菌株的16S rRNA基因，插入pUCm－T載體(上海生工公司)，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α送某公司測(cè)序，所得序列與GenBank的16S rRNA基因序列進(jìn)行blast比對(duì)，初步確定其屬名。所用PCR引物:27F，5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3';1492R，5'-CGGYTACCTTGTTACGACTT-3'［15］。PCR 反 應(yīng)條件見文獻(xiàn)［16］。經(jīng)測(cè)序確定其屬名后知，篩選出來的降解酚優(yōu)勢(shì)菌株為Stenotrophomonas maltophilia K279，在下文中簡寫為 S.maltophilia K279。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 菌落特征 取S.maltophilia K279的菌懸液，并將其制備成10－6、10－7稀釋度的菌懸液，配制有機(jī)固體培養(yǎng)基，用無菌玻璃涂棒在固體培養(yǎng)基上均勻地涂布，室溫下靜置5 min后，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。如圖1所示，即為24 h后所生長的S.maltophilia K279的菌落特征。

從圖1可知，S.maltophilia K279菌落呈淡黃色，單個(gè)菌落呈近似圓形，有些許光澤，質(zhì)地粘稠，菌落略突出于培養(yǎng)基表面且表面濕潤易于挑起接種。由圖1b可知，菌落邊緣較為平整光滑，個(gè)別有略微小鋸齒狀。

2.2 菌株特征 微生物細(xì)胞的形狀、大小、鞭毛、莢膜等都是微生物形態(tài)的重要特征，由于菌體很小，只能在顯微鏡下進(jìn)行觀察測(cè)定。取固體純培養(yǎng)3 d的S.maltophilia K279，用接種環(huán)挑取少許菌落至于載玻片(載玻片用前需浸泡1 d，以減少對(duì)顯微鏡觀察的干擾)上，并滴少量滅菌蒸餾水使載玻片上的菌落得到充分稀釋，待水分蒸發(fā)后，用原子力顯微鏡對(duì)其進(jìn)行觀察測(cè)定。

如圖2所示，從所拍下的單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的圖片可以清楚地觀察到，S.maltophilia K279為短桿菌，形狀呈橢圓狀，無鞭毛無莢膜。原子力顯微鏡拍攝后的圖片可以在Nanoscope 5.30r3sr3軟件上進(jìn)行大小的測(cè)定。圖3即是在Nanoscope 5.30r3sr3軟件上進(jìn)行相關(guān)測(cè)定后所拍下的單個(gè)細(xì)菌的長寬圖片，由軟件測(cè)得 S.maltophilia K279長為 66.591 nm;寬為59.963 nm。

2.3 菌株生長曲線 配制50 ml有機(jī)培養(yǎng)基，向其中加入S.maltophilia K279菌懸液10 ml，在氣浴恒溫振蕩器中以30℃、150 r/min的條件恒溫振蕩培養(yǎng)。每隔2 h測(cè)定一次其吸光度，連續(xù)測(cè)定24 h。圖4為連續(xù)測(cè)定24 h后所作出的S.maltophilia K279生長曲線圖。

如圖4所示，曲線走勢(shì)為較光滑上升式曲線，說明S.maltophilia K279的生長整體呈上升趨勢(shì)，隨著時(shí)間的增加其生長速度也隨之加快。生長曲線可分為3個(gè)階段，第一階段是0～4 h，此時(shí)為緩慢生長階段，吸光度值僅從7.00增加到12.90。第二階段是快速生長階段，在生長到6 h時(shí)吸光度值已經(jīng)達(dá)到了1.20×20(×20表示菌液稀釋了20倍，下同)，近似于2 h測(cè)定時(shí)的3倍，4 h測(cè)定時(shí)的兩倍。因此，從此時(shí)開始細(xì)菌進(jìn)入快速生長階段。第三階段即為穩(wěn)定生長階段，在 S.maltophilia K279 生長16 h時(shí)，吸光度值為3.85 ×20，細(xì)菌的生長開始進(jìn)入穩(wěn)定高峰期，隨后細(xì)菌生長達(dá)到了一個(gè)穩(wěn)定的過程，吸光度值介于3.85×20～4.05×20之間，有較小的波動(dòng)，保持著高效穩(wěn)定的生長勢(shì)頭。由此說明，S.maltophilia K279在培養(yǎng)生長16 h以后，將進(jìn)入一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的生長階段。

3 結(jié)論

以中煤龍華哈爾濱煤化工有限公司廢水處理系統(tǒng)的活性污泥為試驗(yàn)用污泥。通過從中煤龍華哈爾濱煤化工有限公司廢水處理系統(tǒng)中取得的污泥廢水混合物中提取菌懸液，并經(jīng)過含高濃度酚的培養(yǎng)液進(jìn)行優(yōu)勢(shì)菌的篩選培養(yǎng)，通過平板純化手段分離出單一菌株，對(duì)分離出的純菌株進(jìn)行馴化、富集培養(yǎng)。所培養(yǎng)出的降酚優(yōu)勢(shì)菌經(jīng)過PCR擴(kuò)增分離菌株的16S rRNA基因序列來進(jìn)行其分子鑒定，鑒定結(jié)果確定此優(yōu)勢(shì)菌的屬名為Stenotrophomonas maltophilia K279。對(duì)優(yōu)勢(shì)菌S.maltophilia K279進(jìn)行其相關(guān)性質(zhì)的測(cè)定，通過固體培養(yǎng)觀察其基本的菌落特征，菌落略突出于培養(yǎng)基表面且表面濕潤易于挑起接種，顏色呈淡黃色，近似圓形且菌落邊緣較平整光滑，個(gè)別有微鋸齒狀出現(xiàn)，菌落有些許光澤并且質(zhì)地粘稠。在原子力顯微鏡下拍攝單個(gè)細(xì)菌的圖片中，顯示出S.maltophilia K279是短桿、呈橢圓形狀、無鞭毛、無莢膜的細(xì)菌。利用 Nanoscope 5.30r3sr3軟件計(jì)算 S.maltophilia K279單個(gè)細(xì)菌的大小，得出細(xì)菌長為66.591 nm;寬為59.963 nm。在對(duì)此優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的24 h生長培養(yǎng)中，生長曲線整體呈上升趨勢(shì)，大致分為緩慢生長、快速生長和穩(wěn)定生長3個(gè)階段，當(dāng)經(jīng)過16 h的生長培養(yǎng)后，細(xì)菌生長便進(jìn)入其高峰期，并且生長穩(wěn)定，達(dá)到穩(wěn)定的生長階段。

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