肇慶地區柑橘內生菌16S rDNA克隆與序列分析

穆曉琨，李充璧，高飛云，王 玨(肇慶學院生物醫藥工程中心，廣東肇慶526061)

柑橘是世界第一大水果，主要分布在35°N以南的區域，性喜溫暖濕潤，有大水體增溫的地域可向北推至45°N。世界上有135個國家生產柑橘，年產量10 282.2萬t，面積715.3萬 hm2，均居百果之首，產量第 1位的是巴西，為2 425.26萬 t，第2 位美國，為1 633.52 萬t，中國第3，為1 078萬 t，再后是墨西哥、西班牙、伊朗、印度、意大利等國［1］。

柑橘黃龍病是一種世界范圍內的柑橘毀滅性病害，該病最早在我國被發現后的近100年間，已廣泛分布于亞洲、非洲和美洲等地的國家和地區。黃龍病能侵染各種柑橘類植物，病樹主要表現為經濟壽命短，產量低，果品質劣，引起巨大的經濟損失。柑橘樹的經濟壽命原來可達幾十年，乃至上百年，但受黃龍病危害之后，柑橘樹的壽命大大縮短，僅有10年左右。黃龍病曾給東南亞以及我國的廣東、廣西和福建3省區的柑橘產業造成嚴重影響，近年來該病害又有卷土重來之勢［2］。

黃龍病的病原物尚不能人工培養，目前普遍認為原核生物薄壁菌門變形菌綱(Proteobacteria)α-變型菌綱(Alphaproteobaeteriacea)根瘤菌目(Rhizobiales)α-根瘤菌科(Rhizobiaceae)韌皮部桿菌屬(Candidatus Libefibaeter)是引起黃龍病的主要病原。柑橘黃龍病無特效抑制劑，也沒有抗(耐)病品種可供應用。因此，只有通過嚴格地進行檢疫措施、使用無病苗木、及時挖除病樹，以及系統、全面地防治木虱是目前防治黃龍病最有效的方法［3］。

16S rDNA是原核生物分類中最常用和最有效的方法［4］。16S rDNA序列具有高度保守性，可以用來精確鑒定原核生物之間的親緣關系，其所蘊含的信息能反映生物界的進化關系［5］。通過比較其所特有的16S rDNA序列間的同源性差異程度可以判斷種屬及親緣關系，在原核生物的鑒定和分析方面具有重要地位［6］。

為了更好地對黃龍病病原及其分化進行研究，筆者運用PCR技術對從我國廣東省肇慶地區高要、四會、廣寧、封開、懷集5個市縣采集的40多個黃龍病感染柑橘樣品進行了菌種的分離、純化和保存，然后對其16S rDNA序列進行PCR擴增、克隆和DNA測序，并構建系統發育樹。

1 材料與方法

1.1 材料 柑橘黃龍病植株內生菌來自肇慶地區，實驗室分離。克隆用大腸桿菌菌種E.coli TGI、質粒由肇慶學院生物醫藥工程中心保存;克隆載體pMD18-T Vector購自TaKa-Ra公司。

1.2 方法

1.2.1 柑橘內生菌分離。①從懷寧、廣寧等地的柑橘果園，取回無病植株和有病植株的枝葉及土壤，按照常規細菌分離方法進行內生菌分離。②細菌培養。將取自患有黃龍病的柑橘枝、葉部分分離出的病原細菌接入到含有LB培養液的試管中活化、恒溫振蕩培養。

1.2.2 16S rDNA克隆。①細菌DNA提取。將來源肇慶不同地區的柑橘內生菌基因組DNA進行提取，按照北京天根生化科技有限公司細菌基因組DNA提取試劑盒操作步驟進行。②DNA定量。空白對照為250 μl ddH2O，吸取樣本1 μl加入250 μl ddH2O在紫外分光計上測定A260和A280，可得到DNA濃度，進而粗略估計樣品純度。③PCR擴增16S rDNA。設計細菌的通用PCR引物27F:5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3';1429R:5'TAGGGTTACCTTGTTACGACTT 3'。PCR反應條件:95℃預變性3 min;94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個循環;72℃延伸10 min，4℃ 保存。以從肇慶周邊各區縣疑似患有黃龍病的柑橘枝和葉中所分離出的內生菌16S rDNA為模板，用上述引物進行PCR擴增。④電泳檢測16S rDNA片段。⑤目的基因克隆。將純化后的PCR產物與pMD 18-T載體16℃下連接過夜后，轉化感受態細胞DH5α中，涂布于含Amp、X-gal和IPTG的LB平板上，37℃過夜培養。挑選白色菌落接種于含Amp的LB液體培養基中，37℃、200 r/min振蕩過夜培養。

1.2.3 基因序列測定。菌液PCR鑒定后，將篩選的陽性單菌落送至南方基因組中心測序。

2 結果與分析

2.1 16S rDNA片段分離 從柑橘黃龍病植株中分離出內生真菌40株，細菌20株。從細菌中提取出DNA進行PCR擴增，結果擴增出1 261 nt的16S rDNA片段(圖1)。

2.2 序列分析 經序列測定發現，從不同地區柑橘黃龍病植株中分離到的內生菌在健康株中也存在1 261 nt的16S rDNA片段。通過序列分析，可以推測該內生菌與眾多的未能培養的細菌(Uncultured bacterium)都有極高的相似度，其中的測序結果在同源性檢測中，與其相似度最高的是Uncultured bacterium clone yf5-180，達到91.3%。說明此序列是一個較新的序列，是一種與已知細菌種類不同的細菌，因為目前尚未見柑橘黃龍病病原分離培養的報道，也沒有明確確定柑橘黃龍病的病原菌是何種細菌，此種細菌極有可能就是柑橘黃龍病的致病菌。序列測定結果見圖2。

序列分析可知，在NCBI數據庫的同源性對比中，同源性達到90.5% ～91.3%是未能夠培養的細菌 Uncultered candidated bacterGS242.seq 和 Uncultured bacterium clone yf5-180 16S ribosomal RNA gene，同源性相差3%，即可認為是不同種(表1)。

表1 核苷酸序列同源性分析

2.3 進化樹分析 分子進化樹分析表明，該內生菌的16S rDNA親緣關系與未能培養的細菌(Uncultured bacterium)更接近(圖3)。

由圖3可知，各菌株的同源性都在81.0%以上，最高達91.3%。目前已知細菌和植原體16SrDNA基因只要相差3%以上則可定為不同的種。與該內生菌同源性最高的是未能夠培養細菌Uncultered candidated bacterGS242.seq和Uncultured bacterium clone yf5-180，達到 90.5% ～91.3%，故可認為該內生菌雖然與未能培養的細菌(Uncultured bacterium)的親緣關系較為接近，但該內生菌應該屬于一個新的菌株。

3 結論與討論

未能培養的細菌(Uncultured bacterium)主要是指尚未能夠完全分離培養的細菌。因為目前還沒有成功分離培養柑橘黃龍病病原的報道。研究表明，未能培養的細菌在柑橘黃龍病的內生菌所占比例大于5%［7］，該內生菌可能為柑橘黃龍病的病原菌。16S rDNA存在于所有原核生物的細胞中，它是研究細菌分類、進化和親緣關系的重要指標，可用于進化程度不同的生物系統發育研究，特別對于不能進行人工培養的細菌，利用其進行分類是一個有力的工具。目前已知細菌和植原體16S rDNA基因只要相差3%以上則可定為不同的種［8］。

該研究運用分子生物學的方法對廣東肇慶地區柑橘黃龍病植株體的16S rDNA進行PCR擴增，并對擴增產物進行克隆、序列測定及同源關系分析，確定了該植株的分類地位。目前，國內外學者對柑橘黃龍病植株病原進行了大量研究，以期為柑橘黃龍病的防治提供參考依據。從該研究擴增到的肇慶柑橘黃龍病植原體16S rDNA基因中發現一個特殊的序列，在NCBI數據庫的同源性對比中，與其相似度最高的是Uncultered candidated bacterGS242.seq 和 Uncultured bacterium clone yf5-180，達到90.5% ～91.3%。同源性相差3%，即可認為是不同種。盡管有研究利用含有柑橘葉脈提取物的培養基能成功培養出亞洲種黃龍病病原菌，并完成其柯赫氏法則驗證的報道［9］，但該試驗為孤例，尚無重復成功的報道［9］。除了個例，目前還沒有成功分離培養柑桔黃龍病病原的報道，所以該研究發現了一個尚未發現的細菌種屬。此細菌很有可能是柑橘黃龍病的病原菌。對于此細菌的研究是一個較為有價值的課題。

［1］田亞南，柯穗，李韜.應用電鏡與PCR技術檢測王官溪蜜柚黃龍病病原［J］.植物病理學報，2000，30(1):76 －81.

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［3］孔維文，鄧曉玲，梁志慧，等.柑桔黃龍病病原DNA片段的克隆及序列分析［J］.植物病理學報，2000，30(1):71 －75.

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［6］單振菊，馮震，周根，等.沙田柚黃龍病病原16S rDNA片段的克隆與序列分析［J］.廣西農業生物科學，2006，25(1):61 －65.

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［9］SECHLER A，SCHUENZEL E L，COOKE P，et al.Cultivation of‘Candidatus Liberibacter asiaticus’，‘Ca.L.africanus’，and’Ca.L.americanus’associated with Huanglongbing［J］.Phytopathology，2009，99(5):480 －486.