中草藥提取物對蔬菜土傳病原真菌的抑制作用

馬 欣，喬俊卿(.運城職業技術學院有機食品工程系，山西運城044000;.江蘇省農業科學院植物保護研究所，江蘇南京004)

植物土傳病害是指由生活在土壤中的病原體從作物根部或莖部侵害作物而引起的病害［1］，其病原菌一般為多寄主微生物，具有很強的生活能力和侵染能力，在惡劣的環境下具有特殊的生存方式，防治極為困難［2］。目前，我國保護地蔬菜的種植面積不斷增加，種植方式逐步趨于規模化和專業化，形成了很多黃瓜、番茄、辣椒等蔬菜種植基地，已成為農民增收致富的主要渠道［3］。然而，部分地區由于作物種植結構的原因導致設施蔬菜生產高度集約化、復種指數高、蔬菜品種單一［2］、蔬菜生產長期連作、高密度栽培，另外，由于灌溉方法和糞肥使用不當［3］等，為土傳病害病原菌提供了賴以生存的寄主和繁殖場所［2］，從而導致土壤中病原菌大量積累，土傳病害發生日益嚴重。其中，番茄枯萎病和辣椒根腐病就是2種典型的土傳病害，發病嚴重時減產高達50%，甚至絕產，嚴重影響了設施番茄和設施辣椒的產量和質量，給農業生產造成了巨大的損失，已成為番茄和辣椒栽培中的重點防治對象。

目前生產上多采用抗病品種、作物輪作、化學藥劑、生物防治等方法防治蔬菜土傳病害［4］。其中，化學藥劑防治殺菌譜廣、效率高、見效快，但病原菌極易對其產生抗藥性，導致化學農藥施用量不斷增加，在殺滅病原菌的同時也造成有益微生物死亡，破壞了土壤中的原有的微生物平衡，造成農藥殘留量增大、環境污染加劇，威脅人類健康和安全［5］。隨著人們的環保和健康意識逐漸增強，對果蔬病害治理后的農藥殘留、營養價值等問題越來越關注，使化學藥劑的使用受到一定的限制［2］。生物防治方法是一種環境友好的防治措施，但生防微生物容易受到土壤類型、質地、溫度、濕度、pH等理化性質以及氣溫、光照、降雨量及土壤中微生物種群等環境因素的影響，生防效果不穩定［5］。因此，尋找高效、低毒、穩定的新型藥劑和防治方法成為今后防治蔬菜土傳病害的重要目標。

植物是生物活性化合物的天然寶庫，其產生的次生代謝產物超過40萬種，目前人們已經從植物、微生物中提取到多類抗真菌、細菌、病毒、線蟲、殺蟲、除草的活性物質，從植物中探尋新的活性先導化合物或新的農藥靶標，通過類推合成或生物合理設計新利用的開發已成為當今農藥化學和農藥毒理學研究的熱點［6］。然而，目前植物源農藥的研究主要集中在殺蟲活性方面，具有抑菌活性的植物提取物的研究相對較少，而利用中草藥植物防治番茄枯萎病和辣椒根腐病等蔬菜土傳病害的研究報道更少［7］。為此，筆者以番茄枯萎病和辣椒根腐病為防治對象，對8種中草藥植物不同部位提取液的抑菌活性進行了初步篩選，旨在為進一步開發和研制防治蔬菜土傳病害的新型植物源殺菌劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試藥材。試驗用中草藥共8種，隸屬于8個科，均購于山西省運城市中藥市場。供試中草藥種類及使用部位見表1。

1.1.2 供試植物病原菌。番茄枯萎病病原菌(Fusarium oxysporum f.sp.Lycopersici Snyder et Hansen)為實驗室保存;辣椒根腐病病原菌(Fusarium vasinfectum)由江蘇省農業科學院植物保護研究所惠贈。供試菌種均由馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基28℃下繼代培養，并放置在4℃冰箱保存，備用。

表1 供試中草藥

1.2 方法

1.2.1 中草藥提取液的制備。采用超聲波提取法。將陰干的植物材料在45℃恒溫電熱鼓風干燥箱中吹干至發脆，用植物粉碎機粉碎，過80目篩后備用。稱取各植物樣品干粉100 g，用70%乙醇按1∶6的料液比浸泡，攪拌使溶劑完全浸沒中草藥材料，置于避光處靜置24 h后，在45℃、80 Hz的條件下超聲輔助提取30 min，減壓抽濾得濾液，殘渣再次采取相同方法進行處理，重復提取3次，合并3次濾液。將濾液用旋轉蒸發儀40℃條件下減壓濃縮至無溶劑蒸出(呈浸膏狀)，稱重，計算提取率，并置于4℃冰箱中保存備用。然后用50%乙醇定容至2 g/ml，密封編號后置于4℃冰箱中保存備用。

提取率=(濃縮后容器與提取物的總重－容器本身的重量)/樣品的重量×100%

1.2.2 中草藥提取物抑菌活性的離體測定。采用生長速率法。將PDA培養基加熱熔化，冷卻至45～50℃，取供試藥液1.5 ml于培養基中混合均勻制成濃度為30 mg/ml的帶藥培養基，倒入培養皿中，待培養基凝固后，用內徑6 mm的打孔器在菌落邊緣生長旺盛區域打取菌餅，然后用接種針挑至培養皿中心處，每皿1個菌餅，每處理3次重復。以混有70%乙醇的PDA和純PDA培養基作為對照。置于28℃恒溫培養箱中培養。當對照組菌落生長至充滿培養皿約80%時，采用十字交叉法測量供試病菌的菌落直徑，計算生長抑制率。

菌落直徑(mm)=測量菌落直徑平均值－4.0

抑菌率(%)=(對照菌落直徑－處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%

1.2.3 統計分析。利用DPS統計軟件對數據進行顯著性方差分析(Duncan’s新復極差法)。

2 結果與分析

2.1 中草藥乙醇提取物的提取率 由圖1可知，8種中草藥的乙醇提取物中，連翹的提取率最高，為85%，其次是黃芪提取物，提取率為80%，提取率較低的是金錢草和柴胡提取物，提取率均為10%，其余4種中草藥乙醇提取物的提取率均超過10%。上述結果表明，超聲波法提取效率較高，8種中草藥乙醇提取物的提取效率均在10%以上;另外，不同種中草藥的同種溶劑提取物的提取率有所不同。

2.2 中草藥提取物對番茄枯萎病病原菌的抑制作用 在中草藥提取物抑菌活性的離體測定中，8種中草藥提取物均對番茄枯萎病病原菌表現出抑制作用，并且在藥液濃度為30 mg/ml時，不同中草藥的抑菌效果不同，且存在顯著差異，黃柏對番茄枯萎病病原菌的抑菌率最高，為90.77%，其次是黃芪，抑菌率為67.10%，對番茄枯萎病病原菌抑制率最弱的是連翹，抑菌率為11.49%，有3種中草藥的乙醇提取物對番茄枯萎病病原菌的抑菌率在60%以上，分別是黃柏、黃芪和馬齒莧(表2)。因此，選取抑菌效果較好的黃柏等3種中草藥，分別稀釋成不同濃度梯度測定抑菌效果，結果顯示，在一定濃度范圍內，3種中草藥的抑菌活性隨著藥液濃度的降低而減弱，并且呈現顯著差異(表3)。在藥液濃度為30 mg/ml時，黃柏對番茄枯萎病病原菌的抑制作用最強，抑菌率達90%以上。

表2 8種中草藥對番茄枯萎病和辣椒根腐病病原菌的抑菌率 %

2.3 中草藥提取物對辣椒根腐病病原菌的抑制作用 在中草藥提取物抑菌活性的離體測定中，8種中草藥提取物均對辣椒根腐病病原菌表現出抑制作用，并且在藥液濃度為30 mg/ml時，不同中草藥的抑菌效果存在顯著差異，其中，黃柏對辣椒根腐病病原菌的抑菌率最高，為66.09%，其次是馬齒莧，抑菌率為59.66%，對辣椒根腐病病原菌抑制率最弱的是連翹，抑菌率為6.41%，有4種中草藥的乙醇提取物對辣椒根腐病病原菌的抑制率在50%以上，分別是黃柏、馬齒莧、金錢草和穿心蓮(表2)。因此，選取抑菌效果較好的黃柏、馬齒莧和金錢草3種中草藥，分別稀釋成不同濃度梯度測定抑菌效果，結果顯示，在一定濃度范圍內，3種中草藥的抑菌活性隨著藥液濃度的降低而減弱，并且呈現顯著差異(表3)。上述結果表明，在藥液濃度為30 mg/ml時，黃柏對辣椒根腐病病原菌的抑制作用最強，抑菌率達60%以上。

3 討論

試驗采用超聲波法、乙醇對8種不同中草藥植物的化學成分進行提取，并以番茄和辣椒栽培中發生危害較嚴重的2種土傳病害病原菌為供試菌對8種中草藥乙醇提取物的抑菌活性進行了離體測定。研究發現，8種中草藥提取物對番茄枯萎病和辣椒根腐病病原菌都表現出了不同程度的抑菌作用，黃柏、黃芪和馬齒莧的乙醇提取物對番茄枯萎病病原菌的抑菌率達60%以上，黃柏、馬齒莧、金錢草和穿心蓮的乙醇提取物對辣椒根腐病病原菌的抑菌率達50%以上，其中，以黃柏的抑菌效果最好，對番茄枯萎病病原菌的抑制作用高達90%以上，且在一定范圍內，抑菌活性隨著藥液濃度的升高而增強。目前，對黃柏的研究僅局限在對人致病病原菌的抑制作用［8］，有研究證明黃柏的粗提物中含有黃酮醇苷，黃酮醇苷對金黃色葡萄球菌等人類病原菌具有較強的抑制作用［9］，而黃柏對蔬菜土傳病害病原菌的抑制作用方面的研究極度缺乏，今后，可對黃柏提取物的抑菌活性成分、田間使用效果及穩定性進行研究，為開發新型植物源殺菌劑、防治蔬菜土傳病害奠定基礎。

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