鏈霉菌-XY52代謝產物對小瓜蟲的體外殺滅活性研究

姚嘉赟，袁雪梅，徐洋，藺凌云，尹文林，潘曉藝，郝貴杰，沈錦玉(浙江省淡水水產研究所，農業部淡水漁業健康養殖重點實驗室，浙江湖州313001)

小瓜蟲(Ichthyophthirius multifilis)，隸屬纖毛門、寡膜綱、膜口目、凹口科、小瓜蟲屬［1］。該纖毛蟲體被分散排布且長短均一的纖毛，其生活史分為滋養體(Trophont)、包囊體(Tomont)和幼蟲(Theronts)3個階段。滋養體主要寄生在宿主體表，在病灶處呈邊緣明顯的白點，因此該寄生蟲病也稱“白點”病。當滋養體發育成熟并離開魚體后，經過一段時間的游泳后沉到水底，分泌一層透明而有彈性物質將自身包裹形成包囊，經有絲分裂形成幾百上千的幼蟲，幼蟲出包囊后又去感染其他的魚體［2］。小瓜蟲的生活史中不需要中間寄主，其繁殖迅速，同時又是活體寄生，在養殖場內常常爆發流行，給養殖業造成巨大的經濟損失［3］，最嚴重時曾造成年均20～30萬t魚死亡，年均損失達20～30億元。因此，小瓜蟲的防治研究一直都是水產學科研究中的重點和難點。

為了找到有效防治小瓜蟲病的方法，研究者開展了大量探索。孔雀石綠和硝酸亞汞被認為是較為有效的物質，但是因其具有致癌作用目前已被禁用［4］。此后，甲醛［5］、硫酸銅［6］、過氧化氫［7］和高鐵酸鉀［8］等被用于控制小瓜蟲病，雖然有一定的功效，但是長期使用帶來的是環境污染、藥物殘留、耐藥性等一系列問題，也成為目前食品安全和水產品出口的綠色貿易壁壘問題，引起社會各界普遍關注。因此，尋找對小瓜蟲病的治療行之有效、環境友好型藥物是一項迫在眉睫的任務。筆者也利用提取分離技術從天然植物博落回和小果博落回中分離到3種化合物血根堿［9］，二氫血根堿和二氫白屈菜紅堿［10］對小瓜蟲具有較強的殺滅作用。

微生物資源作為自然資源的一大寶庫，蘊藏著巨大的潛力，因其具有特殊的遺傳背景和代謝途徑，能夠產生各種具有特殊功能的酶類及結構新穎、功能多樣性的活性物質，因此在有效創制醫藥、獸藥和農藥等新藥及探索具有生物活性的先導化合物等方面越來越受到重視和青睞。鏈霉菌是放線菌目的一科，而目前約75%的商用、藥用抗生素以及約60%的農用抗生素均是由它們產生［11］。在前期研究中從各地分離到近100種鏈霉菌，發現鏈霉菌XY－52的發酵液具有較強的殺蟲作用。基于此，筆者利用溶劑提取法對其發酵產物進行殺蟲活性部位的研究，旨在為進一步殺蟲活性成分的提取分離奠定基礎，進而為新型殺蟲藥物的創制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗魚 嚴重感染小瓜蟲的草魚(體質量(67.8±5.6)g)來自湖州市東林某養殖場。隨機選取10尾魚，取全鰓鏡檢觀察統計鰓上小瓜蟲數量，試驗魚小瓜蟲感染率為100%，每尾魚平均感染小瓜蟲約110個。健康草魚(體質重(34.2±3.7)g)來自浙江省淡水水產研究所苗種基地。

1.2 鏈霉菌發酵液提取物的制備

1.2.1 鏈霉菌。鏈霉菌(Streptomyces sp)XY-52分離自湖州太湖底泥，經鑒定為鏈霉菌。

1.2.2 發酵液提取物不同溶劑萃取物的制備。鏈霉菌經高氏1號于30℃條件下培養5 d后，3 000 r/min離心15 min，取沉淀經真空冷凍干燥于－20℃冰箱保存備用。

取干燥后的沉淀物溶解于一定量的水中，制成懸浮液，按照溶劑極性由小到大的順序依次加入石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，并經旋轉蒸發干燥，制備成石油醚提取物(Pe-E)、乙酸乙酯提取物(Eto-E)、正丁醇提取物(Nbu-E)、殘留水提取物(Ra-E)。

1.3 體外殺蟲試驗

1.3.1 蟲體的收集。將嚴重感染小瓜蟲的草魚放入燒杯中，待小瓜蟲游出后，用吸管將成熟小瓜蟲收集放入平皿中，一部分蟲體用于小瓜蟲幼蟲的培養，一部分用于包囊的收集［10］。

1.3.2 不同極性提取物對幼蟲的體外殺滅試驗。試驗在24孔細胞培養板上進行，于每個細胞孔中加入約2 ml不同濃度的藥液和約100個小瓜蟲幼蟲，于用藥后15 min、1 h、2 h、3 h、4 h鏡檢觀察1次，4 h后統計各孔的小瓜蟲死亡率。試驗設置DMSO對照組和充分暴氣自然水對照組，每組試驗重復3次。小瓜蟲死亡的判斷標準:蟲體纖毛不運動，胞質不流動，胞膜破裂，細胞核破碎。

1.3.3 不同極性提取物對包囊的體外殺滅試驗。試驗在24孔細胞培養板上進行，于每個細胞孔中加入約2 ml不同濃度的藥液和30個小瓜蟲包囊，于用藥后6 h后，小心吸出藥液，然后加入經紗布過濾的地下水，再放置于22℃的恒溫恒濕培養箱中，培養20～36 h，直至對照組的包囊孵化出幼蟲后試驗結束，統計各孔的小瓜蟲包囊死亡率，同時統計每個細胞孔中的幼蟲的含量。試驗設置DMSO對照組和地下水組，每組試驗重復3次。小瓜蟲包囊死亡的判斷標準為:包囊未分裂或包囊未孵出幼蟲。

1.4 正丁醇提取物對草魚的急性毒性試驗 因為正丁醇提取物對小瓜蟲的體外殺蟲效果最強，故而有必要研究其對草魚的安全性。按照姚［10］等方法進行急性毒性試驗，試驗在階梯式全控溫循環養殖系統中進行，試驗前草魚在水泥池進行適應性養殖7 d以上，自然死亡率小于0.5%后進行毒性預試驗，確定藥物24 h全部致死的最高濃度和96 h全部存活最低濃度，并按等對數間距設計7個濃度:289.0、256.0、225.0、196.0、156.0、144.0 和 121.0 mg/L。試驗條件如下:控溫設備控制水溫(25±1)℃，pH7.0～7.5。按隨機原則、對照原則和重復原則進行藥物毒性試驗，每組10尾草魚，試驗設置3個平行組，并記錄12、24、48和96 h各組草魚的狀況及存活率。

根據平均死亡率，利用直線內插法計算出半致死濃度(LC50):安全濃度 =(24 h LC50×0.3)/(24 h LC50/48 h LC50)3。

1.5 數據處理 使用SPSS 16.0處理藥效數據，結果均以平均值±標準誤表示，采用方差分析進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 發酵液各溶劑提取物對小瓜蟲的殺滅活性研究 從圖1可以看出，在20.0～100.0 mg/L濃度范圍內，石油醚提取物和水殘留提取物對小瓜蟲幼蟲的殺滅率均小于50%;60.0 mg/L的乙酸乙酯提取物對幼蟲的殺滅率為90%，其對幼蟲的半數致死濃度為48.2 mg/L，對幼蟲殺滅效果最好的是正丁醇提取物，30.0 mg/L的正丁醇提取物對幼蟲的殺滅率為100%，其對幼蟲的半數致死濃度為15.5 mg/L，DMSO對照組對幼蟲的殺滅率為0。各提取物對幼蟲的殺蟲活性的順序則依次是正丁醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞水殘留提取物＞石油醚提取物。

由表1可知，石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水殘留提取物對小瓜蟲包囊均具有一定的殺滅作用，但是正丁醇提取物的殺滅效果最強，其濃度為30.0 mg/L時對包囊的殺滅率為100%。其次為乙酸乙酯提取物，其濃度為60.0 mg/L時對包囊的殺滅率為85.6%，DMSO對照組對包囊分裂和孵化沒有影響。同時，正丁醇和乙酸乙酯提取物對包囊的孵化率也明顯的高于石油醚組和水殘留組。

表1 鏈霉菌發酵液4種提取物對小瓜蟲包囊及其孵化率的作用

2.2 正丁醇提取物對草魚的急性毒性試驗 由表2可知，正丁醇提取物對草魚的24 h的半致死濃度為(LC50)為213.7 mg/L;48 h的半致死濃度為(LC50)為195.0 mg/L;96 h的半致死濃度為(LC50)為181.5 mg/L;根據公式計算可得，其安全濃度為48.7 mg/L。

表2 正丁醇提取物對草魚的急性毒性

3 討論

微生物代謝產物因其具有結構新穎性和多樣性，在科學研究和應用開發中具有重要價值，逐漸受到人們的廣泛關注，也已稱為國際微生物學的熱點之一，其在抗菌［12］、殺蟲［13］、抗真菌［14］等各領域得到廣泛的認可并展現出巨大的潛力。然而，目前在水產動物殺蟲藥物研究開發領域還極少，因此該研究對鏈霉菌的發酵產物對小瓜蟲殺滅的活性部位進行研究。微生物發酵產物成分十分復雜，因此僅用某一種溶劑不可能將其所有的組成成分都提取出來，所以有必要采用極性由弱到強的幾種不同溶劑進行提取，使各成分依其在不同極性溶劑中的溶解度差異而分離出來，從而避免最強活性物質的“漏篩”［15］。該研究通過石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇和水5種溶劑對鏈霉菌XY－52進行系統提取，并發現其殺蟲活性部位主要在于其正丁醇部位。

鏈霉菌是一種革蘭氏陽性絲狀放線菌，可產生多種類型的具有重要價值的次級代謝產物，也被人們稱為天然藥物的合成工廠。目前，世界上大部分抗生素和生物聚合物均由其產生，其產生的抗生素主要包括氨基糖苷類、糖肽類、青霉素類、大環內酯類等等［16］。該研究通過離體試驗確定了鏈霉菌發酵產物的主要殺蟲活性部位，但是發酵液提取物一般為混合物，若要確定其功效成分，還必須通過活性追蹤方法對該活性部位進行提取分離，并通過對其結構和功能的關系進行分析才能最終確定殺蟲的活性物質，因而其殺蟲活性物質的分離鑒定有待于進一步研究。

［1］TRAXLER G S，RICHARD J，MCDONALD T E.Ichthyophthirius multifiliis(Ich)epizootics in spawning sockeye salmon in British Columbia，Canada［J］.J Aqua Ani Health，1998，10:143 －151.

［2］Dickerson H W.Ichthyophthirius multifiliis and Cryptocaryon irritans(Phylum)［M］//WOO P T K.Fish Diseases and Disorders.Protozoan and Metazoan Infections，vol.1，2nd ed.Wallingford，UK:CAB International，2006:116 －153.

［3］MATTHEWS R A.Ichthyophthirius multifiliis Fouquet and ichthyophthiriosis in freshwater teleosts［J］.Adv Parasitol，2005，59:159 －241.

［4］WAHLI T，SCHMITT M，MEIER W.Evaluation of alternatives to malachite green oxalate as a therapeutant for ichthyophthiriosis in rainbow-trout，Oncorhynchus mykiss［J］.J Appl Ichthyol，1993，9:237 －249.

［5］ROWLAND S J，MIFSUD C，NIXON M，et al.Use of formalin and copper to control ichthyophthiriosis in the Australian freshwater fish silver perch(Bidyanus bidyanus Mitchell)［J］.Aquacult Res，2009，40:44 －54.

［6］STRAUS D L，HOSSAIN M M，CLARK T G.Strain Differences in Ichthyophthirius multifiliis to Copper Toxicity［J］.Dis Aquat Org，2009，83:31－36.

［7］STRAUS D L，MEINELT T.Acute toxicity of peracetic acid(PAA)formulations to Ichthyophthirius multifiliis theronts［J］.Parasitol Res，2009，104:1237－1241.

［8］LING F，WANG J G，LU C，et al.Effects of aqueous extract of Capsicum frutescens(Solanaceae)against the fish ectoparasite Ichthyophthirius multifiliis［J］.Parasitol Res，2012，111:841 －848.

［9］YAO J Y，SHEN J Y，LI X L，et al.Effect of sanguinarine from the leaves of Macleaya cordata against Ichthyophthirius multifiliis in grass carp(Ctenopharyngodon idella)［J］.Parasitolo Res，2010，107:1035 －1042.

［10］YAO J Y，ZHOU Z M，LI X L，et al.Antiparasitic efficacy of dihydrosanguinarine and dihydrochelerythrine from Macleaya microcarpa against Ichthyophthirius multifiliis in richadsin(Squaliobarbus curriculus)［J］.Vet Parasitol，2011，183:8 －13.

［11］WATVE M G，TICKOO R，JOG M M，et al.How many antibiotics are produced by the genus Streptomyces［J］.Arch Microbiol，2001，176:386 －390.

［12］BECKER J O，ZAVALETA M E，COLBERT S F，et al.Effects of rhizobacteria on root knot nematodes and gall formation［J］.Phytopathology，1988，78:1466 －1469.

［13］SUN M H，GAO L，SHI Y X，et al.Fungi and actinomycetes associated with Meloidogyne spp.eggs and in China and their biocontrol potential［J］.J Invertebr Pathol，2006，93:22 －28.

［14］FATHIMA A Z，ADELINE S Y T.Investigating the bioactivity of cells and cell-free extracts of Streptomyces griseus towards Fusarium oxysporum f.sp.cubense race［J］.Biological Control，2013，66:204 －208.

［15］宋曉平，王晶鈺，李引乾，等.地錦草體外抑菌有效部位的篩選試驗［J］.西北農業大學學報，1999，27(5):75 －78.

［16］MIYADOH S.Research on antibiotic screening in Japan over the last decade:aproducing microorganisms approach［J］.Actinomycetologica，1993，9:100－106.