紫外分光光度法測定豬血中提取免疫球蛋白IgG含量的可行性研究

梁美蓮，顧玉珠，任一丹，于洋(遼寧醫學院，遼寧錦州121001)

我國具有豐富的豬血資源，每年豬血總量約為108kg，豬血由血細胞和血漿組成，血漿蛋白約占血液總量的4.6%，血漿蛋白中含量最高的是白蛋白，其次為免疫球蛋白，約為血漿蛋白的16.3%，占全血的0.75%。根據自由界面電泳結果可知，IgG 屬于 γ 球蛋白［1］。

免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)是一類具有抗體活性或化學結構與抗體相似的球蛋白，其分子呈Y型結構，由長鏈H鏈和短鏈L鏈構成，相對分子質量15 000～90 000，依抗原性不同可分為IgG、IgA、IgM、IgD、IgE等。Ig具有類似蛋白質的通性，加熱至60～70℃即被破壞。它能被中性鹽類沉淀，在紫外區有光吸收，吸光度與其濃度成正比。Ig在pH＜2.6或pH＞7.6時不穩定，若pH＜2.6或pH＞7.6時加熱 Ig變性嚴重［2］。

G型免疫球蛋白(IgG)的相對分子量為160 000，其含量占血清的1.5% ～1.8%，約占血清蛋白總量的17%，血清中免疫球蛋白總量的75%～80%。IgG是動物血清中最重要的抗體，在體液免疫中起著“主力免疫”的作用［1］。血清中Ig的分離方法有飽和硫酸銨分步鹽析法(AS)、辛酸沉淀法、氯化鐵沉淀法、多聚磷酸鹽鹽析法、乙醇分離法、柱色譜分離法及超濾法。免疫球蛋白已被廣泛應用于保健食品、仔畜飼料以及生物新藥和醫藥生化診斷、檢測試劑等，已經成為科學研究和商業等部門重要的物質，隨著人們保健意識的增強，免疫球蛋白功能食品必將進一步開拓市場，產生更大的經濟和社會效益。筆者以豬血為原料，采用飽和硫酸銨法提取新鮮豬血中IgG，采用紫外分光光度法測定提取豬血中IgG含量，研究用紫外分光光度法測定豬血中IgG含量的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 試驗材料。新鮮抗凝豬血:來源于錦州市動物衛生監督所，4 000 r/min離心10 min后得到血漿，－80℃下保存備用。豬IgG對照品，購自北京博爾西科技有限公司;硫酸銨、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉等均為國產分析純。

1.1.2 試驗設備。PHS－3B精密pH計，為上海精科實業有限公司產品;DK－98－11A型恒溫水浴鍋，為天津市泰斯特儀器有限公司產品;TDH－5－A離心機，為上海安亭科學儀器廠產品;SP－752分光光度計為上海光譜儀器公司產品。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制

1.2.1.1 飽和硫酸銨溶液的配制。稱取 150、200、250、300、350、400和450 g硫酸銨，分別加入1 000 ml的蒸餾水，不斷攪拌加熱至40℃，靜置40 min，趁熱過濾，濾液在室溫中過夜，有結晶析出即達到飽和，用氨水調節pH值至7.4。

1.2.1.2 雙縮脲試劑。稱取1.50 g硫酸銅(CuSO4·5H2O)和6.0 g酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6·4H2O)，用 500 ml水溶解，在攪拌下加入300 ml 10%NaOH溶液，溶解后用水定容至1 000 ml，貯存備用。

1.2.2 飽和硫酸銨法提取過程。新鮮抗凝豬血，分離出血漿;加入飽和硫酸銨，恒溫水浴靜置，離心分離，除去纖維蛋白;再加飽和硫酸銨，恒溫水浴靜置，離心分離，所得沉淀即為IgG粗品;粗品經超濾除鹽，冷凍干燥，即為IgG純品。

1.2.3 紫外分光光度法檢測IgG含量。取6個比色皿，分別加入 0、0.4、0.8、1.2、1.6 和 2.0 mg/ml的標準蛋白質溶液 1 ml(各濃度做3個平行管)，用超純水補至2 ml，然后加入4 ml雙縮脲試劑。充分搖勻后，在40℃下放置40 min，于波長543 nm處進行比色測定。

2 結果與分析

飽和硫酸銨沉淀法提取血漿中的免疫球蛋白，是在蛋白質的緩沖液中加入中性的硫酸銨溶液來達到鹽析沉淀蛋白質的目的，因此蛋白質在緩沖液中的溶解度、溫度、靜置時間、pH直接影響到IgG的提取效果。依據文獻采用不同硫酸銨百分比飽和溶液、溫度40℃、靜置時間40 min、pH7.4作為豬血IgG提取參數［3］。

2.1 豬血去除纖維蛋白原 由表1可知，最適宜的硫酸銨濃度為20%，此時纖維蛋白原量最高，達0.189 3 g。

表1 不同硫酸銨濃度下從豬血中提取的纖維蛋白原

2.2 豬血IgG的提取 由表2可知，從豬血中提取IgG最適宜的硫酸銨濃度為35%，此時IgG含量為0.125 2 g。

表2 不同百分比硫酸銨飽和溶液豬血中提取的IgG含量

2.3 紫外分光光度法檢測IgG含量

2.3.1 標準曲線的繪制。紫外分光光度法測得的IgG對照品的A值與其濃度(y)的關系如圖1所示。線性回歸方程為:y=0.960 9x－0.041 8(R2=0.998 6)，表明 lgG 濃度與 A值具有顯著的線性相關性。

2.3.2 待測樣品lgG含量的測定。取出7個比色皿，用上述同樣的方法測定未知樣品的蛋白質濃度，對應于測得的待測IgG的7組A值，計算其濃度(表3)。

表3 樣品中IgG的含量

3 討論與結論

3.1 硫酸銨飽和度與豬血清蛋白沉淀組成的關系 飽和硫酸銨沉淀法提取血漿中的免疫球蛋白，是在蛋白質的緩沖液中加入中性的硫酸銨溶液來達到鹽析沉淀蛋白質的目的，因此蛋白質在緩沖液中的溶解度直接影響到IgG的提取效果［4］。硫酸銨能夠削弱血清中蛋白質的水合程度，降低其溶解度，從而使蛋白質沉淀出來［5］。由于等電點能夠促進蛋白質的析出，因此筆者將樣品 pH調節至7.4，靜置40 min，溫度40℃，獲得IgG最多的硫酸銨濃度為30% ～35%。

3.2 紫外分光光度法檢測提取豬血中IgG活性 動物血清IgG制品種類相當豐富，而與之相對應的測定其含量和活性的方法主要是基于免疫擴散法，包括免疫單擴散和免疫雙擴散，但因為免疫擴散法均是基于沉淀環，導致測量精度不是很好［6］。目前，我國藥典采用的測定方法除了免疫單擴散和免疫雙擴散法［7］外，較簡便的方法就是紫外可見分光光度法［8］，此法系依據血液中的IgG與相應的抗體特異性結合后，在適宜的電解質、溫度、pH條件下產生凝集反應，形成抗原抗體復合物，根據供試品的吸光度計算出其中IgG的含量。紫外分光光度法測定的結果包含了部分殘存的雜蛋白和有活性及無活性的IgG。同免疫單擴散方法測定動物血清IgG制品含量相比，紫外分光光度方法數據穩定，線性關系好，準確性高，費時短，方法簡便易行，適合推廣。

硫酸銨法分離豬血中免疫球蛋白，溫度40℃，靜置40 min，pH7.4時，去除纖維蛋白原的最適飽和硫酸銨溶液濃度為20%;獲得粗IgG最多的硫酸銨濃度為35%;IgG含量最高時硫酸銨濃度為35%。

［1］臧盛，張立娟，吳明文，等.豬血免疫球蛋白的研究進展［J］.肉類工業，2011(1):52－54.

［2］郭本恒，駱承癢.牛初乳免疫球蛋白變性動力學研究［J］.食品科學，1996，17(7):10 －13.

［3］胡曉艷，王春維，趙勝軍，等.飽和硫酸銨法提取IgG工藝的優化［J］.中國糧油學報，2009，24(1):119 －120.

［4］崔妍妍.免疫球蛋白的檢測及分離技術分析［J］.吉林醫學，2014(14):3100 －3101.

［5］張宜濤，于偉，江國永，成國祥.兩種方法純化豬血清免疫球蛋白IgG的比較［J］.飼料與畜牧，2012(2):41－43.

［6］張效榮，于福滿，程瑜茗.豬血免疫球蛋白提取條件的優化研究［J］.肉類工業，2014(9):23－26.

［7］陳雅蕙，陳來同，胡曉倩，等.生物化學實驗原理和方法［M］.北京:北京大學出版社，2005.

［8］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(三部)［S］.北京:化學工業出版社，2005:附錄XIK.